羅爾阿太菌生長(zhǎng)曲線、原生質(zhì)體制備條件及融合技術(shù)（四）
2.4融合條件對(duì)原生質(zhì)體融合率的影響
融合條件對(duì)原生質(zhì)體融合率的影響見圖3，由圖3a可以看出，隨著PEG6000濃度的增加，原生質(zhì)體融合率先增加后降低。當(dāng)PEG6000為0.4 g·mL——1時(shí)，原生質(zhì)體融合率為6.792%.原因可能是PEG6000在原生質(zhì)體融合過程中既作為誘導(dǎo)劑又作為穩(wěn)定劑，濃度低時(shí)誘導(dǎo)作用不明顯，濃度高時(shí)原生質(zhì)體不穩(wěn)定易破裂，致使原生質(zhì)體融合率降低。
由圖3b可以看出，隨著融合時(shí)間的增加，原生質(zhì)體融合率先增加后降低。當(dāng)融合時(shí)間為25 min時(shí)，原生質(zhì)體融合率為6.543%.可能原因是融合時(shí)間短，原生質(zhì)體融合不完全。融合時(shí)間長(zhǎng)，PEG6000會(huì)對(duì)細(xì)胞造成毒害作用，致使原生質(zhì)體融合率降低。
由圖3c可以看出，隨著融合溫度的增加，原生質(zhì)體融合率先增加后降低。當(dāng)融合溫度為30℃時(shí)，原生質(zhì)體融合率為6.452%.原因可能是融合溫度低時(shí)達(dá)不到融合條件，融合溫度高時(shí)抑制PEG6000作用，致使原生質(zhì)體融合率降低。
圖3融合條件對(duì)原生質(zhì)體融合率的影響
2.5融合子的篩選
2.5.1原生質(zhì)體融合子形態(tài)
原生質(zhì)體融合子形態(tài)見圖4，原生質(zhì)體經(jīng)紫外和熱處理滅活后，致死率為100%，在雙層再生培養(yǎng)基上不再生長(zhǎng)。原生質(zhì)體融合后在再生培養(yǎng)基上長(zhǎng)出融合子，最初是1個(gè)白色圓形的點(diǎn)，隨后菌絲向外萌發(fā)生長(zhǎng)，通常需要6——9 d.
圖4原生質(zhì)體融合子形態(tài)
2.5.2篩選菌株多糖及草酸含量經(jīng)原生質(zhì)體融合篩選出了4個(gè)菌株，分別命名為AY-1、AY-2、AY-3、AY-4，在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)5.5 d后測(cè)得多糖及草酸產(chǎn)量見表3.
表3篩選菌株的多糖和草酸產(chǎn)量
表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（n=3），同列數(shù)據(jù)后凡是有一個(gè)相同小寫字母者，表示差異不顯著（Duncan’s法，P＞0.05）。
由表3可以看出，經(jīng)原生質(zhì)體融合選育的菌株中，除菌株AY-1的多糖產(chǎn)量下降外，其他菌株多糖產(chǎn)量都高于Ar-1和Ar-2，菌株AY-3和AY-4多糖產(chǎn)量較高，分別比原始菌株的產(chǎn)糖量提高了54.42%和45.18%.此外，菌株AY-3草酸產(chǎn)量最低，為0.281 g·L——1，比原始菌株的草酸產(chǎn)量降低了43.57%.菌株AY-1、AY-2、AY-3、AY-4多糖產(chǎn)量均與原始菌株差異顯著（P＜0.05）。草酸產(chǎn)量除菌株AY-4與原始菌株差異不顯著外（P＞0.05），菌株AY-1、AY-2、AY-3均與原始菌株差異顯著（P＜0.05）。菌株AY-3的多糖產(chǎn)量、多糖產(chǎn)量變化、草酸產(chǎn)量、草酸產(chǎn)量變化均與其他菌株差異顯著（P＜0.05），為最佳產(chǎn)糖菌株。
3討論與結(jié)論
真菌原生質(zhì)體融合技術(shù)不僅打破了微生物種界界限，還能保持完整的遺傳物質(zhì)，從而完成菌株基因重組，重組后的融合子具有雙親遺傳性狀，能夠表現(xiàn)出雙親的優(yōu)良性狀。本研究中以羅爾阿太菌菌株AY6657741為原始菌株，誘變株Ar-1和Ar-2為雙親菌株，以玉米淀粉和玉米黃漿為培養(yǎng)基，采用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育的羅爾阿太菌菌株多糖產(chǎn)量高達(dá)24.673 g·L——1.本試驗(yàn)中多糖產(chǎn)量與Shrikant等的研究相比，產(chǎn)糖量提高了10.54%.這表明原生質(zhì)體融合技術(shù)能較好地提高羅爾阿太菌分泌多糖的能力，為今后進(jìn)一步提高多糖產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)。
本試驗(yàn)中采用紫外照射和熱處理方法滅活雙親原生質(zhì)體，但紫外處理和熱處理在一定條件下有可逆性，因此融合培養(yǎng)后的菌株具有不穩(wěn)定性，其性狀特征可能很快失去，所以必須傳代數(shù)次保證其性狀的穩(wěn)定性。另外在發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)，伴隨多糖的產(chǎn)生，會(huì)生成草酸，使發(fā)酵液pH由4.55很快降至2.00左右，從而抑制了多糖的分泌，當(dāng)草酸產(chǎn)量高于0.368 g·L——1時(shí)，多糖產(chǎn)量就會(huì)受到影響。采用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育出的菌株AY-3滿足了草酸低產(chǎn)，多糖高產(chǎn)的要求。
目前高產(chǎn)羅爾阿太菌多糖生產(chǎn)專利技術(shù)由Cargill公司擁有，我國(guó)只能依賴進(jìn)口。本研究中獲得的菌株AY-3可為我國(guó)獲得擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的羅爾阿太菌多糖工藝技術(shù)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。今后的研究將進(jìn)一步探討AY-3生產(chǎn)多糖的工藝，以期為該糖工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
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