微生物生長曲線監(jiān)測系統(tǒng)：12種LAB發(fā)酵物對霉菌生長的抑制作用
霉菌腐敗是乳制品行業(yè)的一個主要問題，導(dǎo)致大量食物浪費和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。乳制品為霉菌生長提供了有利的環(huán)境，由于產(chǎn)品表面的生長，可以發(fā)現(xiàn)明顯的變化。一些最常見的霉菌，例如青霉屬和毛霉屬，與乳制品腐敗有關(guān)。為了避免食品工業(yè)中的真菌腐敗，在產(chǎn)品制造過程中采取了很多措施來防止污染并抑制真菌生長。化學(xué)防腐劑已在食品工業(yè)中使用，以保護(hù)食品免受不良生長，從而延長產(chǎn)品保質(zhì)期，但公眾對化學(xué)防腐劑的廣泛使用越來越關(guān)注。此外，越來越多的霉菌不僅對抗生素產(chǎn)生抗藥性，而且對山梨酸和苯甲酸等食品防腐劑產(chǎn)生抗藥性。近年來，消費者對最低限度加工或不含防腐劑的食品的需求不斷增加，這導(dǎo)致人們對天然真菌控制替代品（例如抗真菌生物保護(hù)培養(yǎng)物）越來越感興趣。選定的乳酸菌（LAB）通常被報道為潛在的生物保存工具，可以抑制不同食品中的真菌生長，延長保質(zhì)期，有時甚至改善營養(yǎng)價值和感官特性。LAB菌株對抗腐敗霉菌的活性機(jī)制被認(rèn)為是多因素的，包括產(chǎn)生各種代謝物，包括揮發(fā)性化合物和非揮發(fā)性化合物。
本研究的目的是表征從新鮮發(fā)酵的乳制品（例如酸奶）中分離出的一組霉菌在三種溫度下的生長潛力。通過評估霉菌與有或沒有活細(xì)胞的LAB發(fā)酵物的直接相互作用效應(yīng)，以及評估揮發(fā)物的作用的無直接接觸，來研究霉菌對不同LAB制劑的敏感性。評估選定組合中12種LAB培養(yǎng)物對這些霉菌生長的抑制作用。研究錳消耗導(dǎo)致的競爭排斥在抑制中的作用。
丹麥Biosense微生物生長曲線監(jiān)測系統(tǒng)的應(yīng)用
在25°C下監(jiān)測霉菌細(xì)胞生長24小時。使用微生物生長曲線監(jiān)測oCelloScope檢測系統(tǒng)（BioSense丹麥），這是一種新開發(fā)的光學(xué)檢測系統(tǒng)，基于結(jié)合光學(xué)技術(shù)的獨特光學(xué)掃描技術(shù)FluidScope TM。將每個霉菌的100微升MEB培養(yǎng)基中的孢子懸浮液（1.0×103孢子/mL）添加到96孔微孔板中（大約100個孢子/孔）。接種后將96孔微孔板在室溫下靜置約1小時，讓孢子在這些孔中沉降，然后放入oCelloScope系統(tǒng)中。自動測量樣品，并在24小時內(nèi)每60分鐘記錄一次儀器得出的生長值。使用oCelloScope專用軟件UniExplorer(v.5.0.3)的背景校正吸收(BCA)算法{BCA=log10[Σ（校正吸收像素直方圖）]}進(jìn)行自動生長動力學(xué)分析。對于每種霉菌菌株，通過三個技術(shù)重復(fù)進(jìn)行生長測試。
實驗結(jié)論
乳制品非常容易受到腐敗霉菌的影響，因此表征霉菌的生長潛力至關(guān)重要。毛霉菌株在MEB培養(yǎng)基和酸奶中的生長速度都比青霉菌菌株快。除P.roqueforti ISI4外，所有測試的霉菌在MRS中生長時均受到12種LAB菌株的強烈抑制。從基于MRS的發(fā)酵液中去除LAB活細(xì)胞后，抑制效果下降，單獨揮發(fā)物的效果更小，表明預(yù)形成的化合物發(fā)揮了作用，但它們不是主要的抑制因素。當(dāng)使用酸奶血清作為培養(yǎng)基時，觀察到乳酸菌生長減少和霉菌生長抑制較弱，而去除細(xì)胞導(dǎo)致活性幾乎完全喪失。在某些情況下，通過組合培養(yǎng)物可以增強抑制功效。在酸奶中，植物乳桿菌LP37造成的錳消耗在青霉菌和毛霉菌測試菌株的生長抑制中發(fā)揮著重要作用。因此除了未受影響的P.roqueforti ISI4之外，這些腐敗霉菌通常對能夠使基質(zhì)中的錳無法利用的生物保護(hù)培養(yǎng)物敏感。
圖1、(A)oCelloScope監(jiān)測的13種霉菌生長動力學(xué)分析。數(shù)據(jù)以三個重復(fù)的平均值表示。將MEB中每種孢子懸浮液100微升(1.0×103孢子/mL)加入96孔微孔板中，一式三次，25℃孵育24 h。4株毛霉的生長曲線為點線，9株青霉的生長曲線為實線。(B)在MEB培養(yǎng)基中生長的P.solitum ISI5(a)和M.circinelloides 01180023(B)的ocloscope圖像。比例尺:104μm。對13個霉菌在25°C下在MEB培養(yǎng)基中24小時的生長動力學(xué)分析（圖1A）表明，所有測試霉菌的初始接種量大致處于同一水平（100個孢子/孔），但觀察到較大差異在增長潛力方面。毛霉菌株通常比青霉菌菌株生長得更快，其中M.plumbeus 01180036是生長最快的分離株。M.circinelloides 01180023是第一個在大約10小時后達(dá)到穩(wěn)定期的分離株，但達(dá)到的最高水平低于其他菌株。青霉屬菌株中生長最快的分離株是青霉ISI3，其生長速度幾乎與鉛青霉菌株一樣快。相比之下，P.roqueforti ISI4細(xì)胞相對于其他測試菌株表現(xiàn)出最慢的初始生長。
圖2、(A)用含有P.roqueforti ISI4的0.5%麥芽提取物軟瓊脂覆蓋的LAB培養(yǎng)物的抗真菌抑制評分示例。對照：沒有抗真菌培養(yǎng)物的MRS瓊脂，上面覆蓋有霉菌；“+++”：強抑制；“++”：弱抑制；“+”：生長但產(chǎn)孢延遲；“-”：無抑制。(B)板對板系統(tǒng)。L.parabuchneri LPB02（上板）產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物對MEA板（下圖）上P.commune 01180002生長的抑制作用。在密閉室中，分別評估了P.commune 01180002在底部MEA板上的生長情況，頂部(b)上有L.parabuchneri LPB02板的MRS發(fā)酵物，頂部(a)上有對照板。
圖3、13種霉菌在酸奶瓊脂平板上的生長潛力，分別在5°C(A)、16°C(B)和25°C(C)下培養(yǎng)長達(dá)24天。通過將每個孢子懸浮液（20μL，1.0×10 5孢子/mL）點樣在酸奶瓊脂平板上一式三份來確定測試。條形代表三個重復(fù)的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。四種毛霉菌株用虛線標(biāo)記；九個青霉菌菌株，帶有實線。虛線框中（B，C）的生長曲線被放大。
圖4、13個霉菌分別對12種含有活細(xì)胞的LAB發(fā)酵液(A)、LAB無細(xì)胞發(fā)酵液(B)以及MRS中LAB培養(yǎng)物的揮發(fā)物(C)的敏感性。LAB菌株代碼：LRH01、LRH05、LRH14、LRH16和LRH43為鼠李糖乳桿菌菌株，LP01、LP37和LP48植物乳桿菌菌株，LPC44和LPC46副干酪乳桿菌菌株，以及LPB02和LPB04 L.parabuchneri菌株。
圖5、酸奶中植物乳桿菌LP37造成的錳消耗。如所示添加不同濃度的錳（0.001、0.01和0.1 mM）。將帶有斑點青霉菌菌株和毛霉菌株（200個孢子/斑點）的平板在25°C下孵育5天。條形代表三個重復(fù)的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。Bio-LP37表示培養(yǎng)物植物乳桿菌LP37。閉合符號表示青霉菌菌株；空心符號表示毛霉菌株。
總結(jié)
由于食物浪費和經(jīng)濟(jì)損失，乳制品的真菌腐敗是一個主要問題，一些真菌代謝物還可能對人類健康產(chǎn)生不利影響。乳酸菌(LAB)的使用正在成為化學(xué)防腐劑的潛在清潔標(biāo)簽替代品。本研究的目標(biāo)是表征從乳制品中分離出的一組霉菌（四種毛霉菌株和九種青霉菌菌株）在三種儲存溫度（5°C、16°C和25°C）下的生長潛力，然后研究這些霉菌對12種培養(yǎng)基的生長影響。使用Biosense微生物生長曲線監(jiān)測系統(tǒng)在25°C下監(jiān)測麥芽提取物肉湯中的真菌細(xì)胞生長和形態(tài)24小時。
使用oCelloScope檢測系統(tǒng)實時監(jiān)測霉菌的生長曲線，oCelloScope檢測系統(tǒng)是一個基于自動光學(xué)檢測系統(tǒng)的小型便攜式平臺。該方法可用于在三維菌絲網(wǎng)絡(luò)形成之前早期檢測生長情況。還在不同溫度下孵育的酸奶瓊脂平板上進(jìn)行了生長跟蹤，其中選擇5°C模擬冷藏溫度、16°C濫用冷鏈溫度和25°C室溫。oCelloScope測試和酸奶瓊脂斑點測試的結(jié)果非常一致。在測試的霉菌中，毛霉01180036是生長最快的，而青霉菌ISI4(P.roqueforti ISI4)是生長最慢的。在酸奶瓊脂平板上，所有霉菌都在5°C、16°C和25°C下以溫度依賴性方式生長，無論溫度如何，毛霉菌株都比青霉菌菌株生長得更快。使用高通量疊加方法測試了對12種LAB培養(yǎng)物的敏感性，其中除P.roqueforti ISI4之外的所有霉菌均受到強烈抑制。當(dāng)在含有LAB菌株活細(xì)胞的瓊脂平板上發(fā)現(xiàn)霉菌孢子時，這些LAB的抗真菌作用得到了證實。與酸奶血清中的單一培養(yǎng)物相比，一些LAB二元組合提高了針對多種霉菌生長的抗真菌活性。對六種青霉菌和兩種毛霉菌株的可能抗真菌機(jī)制進(jìn)行了檢查，因為錳耗盡導(dǎo)致的競爭排斥作用。本研究表明，除了未抑制的P.roqueforti ISI4之外，這種機(jī)制是測試霉菌的主要抑制因素，因為添加錳濃度增加至0.1 mM導(dǎo)致酸奶中霉菌生長部分或完全恢復(fù)。這些發(fā)現(xiàn)有助于了解影響乳制品霉菌腐敗的參數(shù)以及污染菌株、底物和生物保護(hù)性實驗室培養(yǎng)物之間的相互作用。
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