適用于貴州貞豐地區(qū)的發(fā)酵床微生物菌劑生長曲線
發(fā)酵床技術(shù)從2004年從日本引進(jìn)到國內(nèi)，從原先單一菌劑發(fā)酵床到復(fù)合菌劑發(fā)酵床的開發(fā)應(yīng)用，使得發(fā)酵床技術(shù)逐步穩(wěn)定成熟。發(fā)酵床菌劑應(yīng)用廣泛，在用于制作發(fā)酵床方面，可以達(dá)到分解動物糞便的目的，從而增加效益、減少污染等。
貴州地處喀斯特地貌，多氣候的特殊環(huán)境，微生物菌劑在貴州產(chǎn)酶、產(chǎn)孢等能力減弱。此外，貴州不同地區(qū)環(huán)境氣候等差異較大，同一株微生物在不同地區(qū)的繁殖代謝能力也不一樣。
目前，現(xiàn)有的發(fā)酵床菌種在貴州地區(qū)的應(yīng)用存在以下缺陷：
1.現(xiàn)有發(fā)酵床菌種復(fù)合配方同質(zhì)化嚴(yán)重，并且在貴州的實際表現(xiàn)能力較差，死床率高等。
2.現(xiàn)有發(fā)酵床菌種成本高，效果不佳，應(yīng)用時間短。
為此，下面一種適用于貴州貞豐地區(qū)的發(fā)酵床菌劑及制備方法，以解決上述問題。
在貞豐地區(qū)采集土著微生物，并在實驗室分離培養(yǎng)發(fā)酵床核心菌群，對核心菌群的生長曲線，代謝酶濃度測定評估，組合形成適用于貴州貞豐地區(qū)的發(fā)酵床菌劑配方。涉及的菌種及配方能較高適宜貞豐地區(qū)發(fā)酵床應(yīng)用及持續(xù)穩(wěn)定運(yùn)營。
菌種保藏
芽孢桿菌：拉丁學(xué)名為Bac i l l us sp.，保藏于中國廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC NO：63150。
乳球菌：拉丁學(xué)名為：Lactococcus sp.，保藏于中國廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC NO：63149。
植物乳桿菌：拉丁學(xué)名為：Lact i p l ant i bac i l l us p l antarum，保藏于中國廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC NO：63152。
酵母菌：拉丁學(xué)名為Saccharomyces sp.，保藏于中國廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC NO：63151。
屎腸球菌，拉丁學(xué)名為Enterococcus faec i um，保藏于中國廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC NO：63145。
乳球菌的生長曲線圖；
芽孢桿菌的生長曲線圖；
酵母菌的生長曲線圖；
屎腸球菌的生長曲線圖；
適用于貴州貞豐地區(qū)的發(fā)酵床菌劑及制備步驟：
1)、采樣：將7分熟的米飯裝入采樣木盒中，滴上6-7mL營養(yǎng)液，放入貞豐長田鎮(zhèn)甘田村深山內(nèi)，挖坑將培養(yǎng)盒放入，用腐殖土和白色菌絲體土壤覆蓋，并在四周挖排水溝，防止水直接進(jìn)入培養(yǎng)土坑中，7日后返回收集樣本。
2)、樣品前處理：用1:1甘油保存液將部分樣本進(jìn)行保種；取1mL液體，用9mL生理鹽水稀釋，記住10-1濃度，以此方法逐級稀釋至10-5、10-6濃度，選用肉湯培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，將10-5、10-6濃度的稀釋液各取1mL涂布于肉湯培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)72h。
3)、培養(yǎng)基配制：肉湯瓊脂培養(yǎng)基(牛肉粉5g、蛋白胨20g、氯化鈉5g、瓊脂15g、水1000mL、pH7.0～7.2),馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g、瓊脂15g、水1000mL)，屎腸球菌選擇性培養(yǎng)基(月示胨10g，麥芽糖10g，酵母粉10g，甘油磷酸鈉10g，氯化鈉5g，乳糖1g，溴甲酚紫0.015g，疊氮鈉0.4g，TCC 0.1g，瓊脂13g)，LB瓊脂胨培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g、氯化鈉10g、瓊脂15g、水1000mL、pH6.9～7.1)、MRS瓊脂培養(yǎng)基(胰酪胨10g、牛肉膏粉5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、乙酸鈉5g、檸檬酸三胺2g、吐溫80 1g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂0.2g、硫酸錳0.05g、瓊脂15g、水1000mL、pH6.0～6.4)，酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨20g、葡萄糖20g、酵母浸粉10g、瓊脂15g、水1000mL、pH6.3～6.7)，LB液體胨培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g、氯化鈉10g、水1000mL、pH6.9～7.1)、MRS液體培養(yǎng)基(胰酪胨10g、牛肉膏粉5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、乙酸鈉5g、檸檬酸三胺2g、吐溫80 1g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂0.2g、硫酸錳0.05g、水1000mL、pH6.2～6.4)，酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基(YPD液體培養(yǎng)基：蛋白胨20g、葡萄糖20g、酵母浸粉10g、水1000mL、pH6.3～6.7)。
4)、菌種復(fù)篩：初篩菌種培養(yǎng)結(jié)束后，從肉湯培養(yǎng)基上選取1-2株菌落分別在MRS瓊脂、LB瓊脂、屎腸球菌選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，38℃培養(yǎng)72h；從PDA瓊脂培養(yǎng)基上選取形態(tài)結(jié)構(gòu)較大菌落在YPD瓊脂培養(yǎng)基涂布，30℃培養(yǎng)7d。
5)、菌種鑒定檢測：從4組培養(yǎng)基中分離出的菌種通過析澤生物Z200菌落計數(shù)器進(jìn)行菌落形態(tài)分析，結(jié)合菌種生長形態(tài)結(jié)構(gòu)初判菌種種類；其次將菌泥使用革蘭氏染液染色后進(jìn)行鏡檢；無法判斷的菌種再培養(yǎng)后送往蘇州帕米諾克生物公司測序鑒定。
6)、菌種生長曲線檢測：將分離純化的菌種按照5％的菌液接種量接種到對應(yīng)液體培養(yǎng)基中，每隔1h取樣5mL，利用普析T6紫外分光光度計在620nm測定菌種OD值。
7)、產(chǎn)品對照實驗：采購某品牌發(fā)酵床菌劑10kg，取1g菌粉置于肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，38℃培養(yǎng)72h；分離純化貴州地區(qū)菌種主要為芽孢桿菌、乳球菌、植物乳桿菌、屎腸球菌、酵母菌等，將分離純化菌種在對應(yīng)培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后使用盧湘儀18M離心機(jī)離心，將離心菌泥與保護(hù)劑1:1混合后使用四環(huán)福瑞0.05平方實驗室小型凍干機(jī)凍干32h，凍干后的單菌粉其復(fù)合比例為4:1:1:2:2，將復(fù)合后的復(fù)合菌粉1g也置于肉湯培養(yǎng)基中38℃培養(yǎng)72h。將培養(yǎng)好的菌液測定其活菌數(shù)、pH、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶。
8)、貞豐地區(qū)驗證實驗：將市場產(chǎn)品和復(fù)合好的貞豐地區(qū)菌種產(chǎn)品都按1:5與玉米面混合撒勻在甘田村發(fā)酵床上進(jìn)行產(chǎn)品臨床實驗，每月進(jìn)行1次采樣，采樣后測定活菌數(shù)、pH、酶活等。
結(jié)果表明：乳球菌在48h時達(dá)到最大峰值，芽孢桿菌和酵母菌在20-30h之間達(dá)到峰值，生產(chǎn)繁殖情況較市場購買菌種優(yōu)異。
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