新一代益生菌Akk在兩種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況與差異性代謝組學(xué)分析結(jié)果（一）
嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila，Akk）被稱作新一代益生菌，是一種典型的哺乳動(dòng)物腸道菌，依賴于腸道上皮細(xì)胞分泌的黏蛋白生存，是腸道黏液層的關(guān)鍵微生物，更與多種疾病存在重要關(guān)聯(lián)。Akk作為一種典型的腸道菌，只能耐受低濃度的氧氣，其體外培養(yǎng)更是生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、生長(zhǎng)速度慢。本團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，Akk可利用硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基，且該培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單價(jià)格便宜，唯其生長(zhǎng)速度較為緩慢。
東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的武曉玲、徐珒昭、許曉曦*等人利用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)比分析Akk在硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)物的差異，結(jié)合京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路探究其特征性代謝產(chǎn)物與疾病的關(guān)聯(lián)，并以此證明優(yōu)化培養(yǎng)基在工業(yè)化高密度培養(yǎng)中的優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用前景，旨在為Akk在中國的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)基礎(chǔ)。
1 Akk在兩種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況對(duì)比
由于Akk在硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)其菌液密度極低（生長(zhǎng)速度慢且活菌數(shù)較少），因此本課題組前期在硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，對(duì)Akk培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。為確定Akk在兩種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)穩(wěn)定期以制備發(fā)酵上清液樣本，并對(duì)比Akk在兩種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，通過測(cè)定菌液OD600 nm并繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖1所示。
由圖1可知，0～8 h為Akk的生長(zhǎng)遲緩期，12 h左右進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。在硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中，Akk生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期為12～32 h，32 h菌液OD600 nm達(dá)到最高（0.269±0.003），之后進(jìn)入穩(wěn)定期，穩(wěn)定期活菌數(shù)為6.75×107 CFU/mL。而在優(yōu)化培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期同樣在12 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)期，44 h時(shí)菌液OD600 nm最高可達(dá)0.761±0.011，是硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基的2.83倍，并在44 h之后趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定期的活菌數(shù)為1.74×109 CFU/mL，比硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基高出2個(gè)數(shù)量級(jí)。由此可知，優(yōu)化后的培養(yǎng)基雖相對(duì)延長(zhǎng)了Akk的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，但顯著提高了Akk的菌液密度及活菌數(shù)。并由此選擇其在硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基中進(jìn)入生長(zhǎng)旺盛期的32 h和44 h發(fā)酵上清液，用以分析兩組樣本的差異代謝物。
2差異性代謝組學(xué)分析結(jié)果
2.1 QC分析
為評(píng)價(jià)儀器的穩(wěn)定性及數(shù)據(jù)質(zhì)量的可靠性，分別在正負(fù)離子模式下將QC樣本總離子流圖進(jìn)行譜圖重疊比較，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明兩種模式下各色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度和保留時(shí)間均基本重疊，說明在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中儀器誤差引起的變異較小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為可靠。
2.2代謝物鑒定數(shù)量及化學(xué)分類歸屬統(tǒng)計(jì)
通過高效液相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)Akk在兩種培養(yǎng)基發(fā)酵上清液中的代謝產(chǎn)物，正負(fù)離子模式下合計(jì)鑒定到代謝產(chǎn)物2 253種，其中正離子模式下鑒定到代謝產(chǎn)物1 585種，負(fù)離子模式下鑒定到668種。根據(jù)化學(xué)分類歸屬信息將所有代謝物進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，各類代謝物數(shù)量所占比例如圖3所示。
兩組樣本中檢測(cè)到的代謝物包括有機(jī)酸及其衍生物（34.976%），脂質(zhì)和脂質(zhì)類分子（21.127%），有機(jī)雜環(huán)化合物（10.567%），苯甲酸類（6.569%），有機(jī)氧化合物（5.237%），苯丙烷和聚酮（4.172%），核苷、核苷酸和類似物（2.308%），有機(jī)氮化合物（1.243%），生物堿及其衍生物（0.666%），木質(zhì)素、新木質(zhì)素及相關(guān)化合物（0.178%），有機(jī)金屬化合物（0.133%），有機(jī)硫化合物（0.133%），烴類衍生物（0.089%）和未命名化合物（12.605%）等。
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