醇類、小分子有機(jī)酸和糖類等不同碳源對(duì)微生物硫酸鹽還原菌的影響
硫酸鹽含量過(guò)高會(huì)對(duì)環(huán)境和人類健康構(gòu)成威脅。為了解決硫酸鹽污染問(wèn)題并為硫酸鹽去除和硫磺回收提供依據(jù)，本研究旨在探索硫酸鹽還原菌（SRB）容易利用的有機(jī)物。為了研究SRB對(duì)不同有機(jī)質(zhì)的利用特性，本研究調(diào)查了不同碳源（包括醇類、小分子有機(jī)酸和糖類）和不同碳硫(C/S)下的微生物硫酸鹽還原。不同碳源轉(zhuǎn)化途徑的差異是影響硫酸鹽還原過(guò)程的主要因素。研究發(fā)現(xiàn)不完全氧化的SRB能快速將糖類和醇類不完全氧化成乙酸，并降低溶液pH，從而抑制SRB的活性。相反，使用小分子有機(jī)酸作為碳源時(shí)能維持較為穩(wěn)定的pH，并檢測(cè)到更多的硫化物。在所有測(cè)試的碳源中，使用丙酸鹽、乳酸、乙醇和甲酸鹽作為碳源時(shí)，觀察到更快的硫酸鹽還原，最佳C/S是化學(xué)計(jì)量比的三倍。碳源的類型也通過(guò)影響微生物群落結(jié)構(gòu)來(lái)影響硫酸鹽還原。乙醇和丙酸鹽的存在有利于不完全氧化SRB（Desulfomicrobiaceae和Desulfovibrionaceae）的增殖，而完全氧化的SRB（Desulfuromonadaceae和Desulfococccaceae）在含甲酸鹽的底物中占主導(dǎo)地位。不完全氧化菌通常生長(zhǎng)較快，往往具有較高的電子傳輸系統(tǒng)活性，但碳源利用效率較低。
研究概述
在19種測(cè)試的有機(jī)物中，丙酸鹽作為碳源時(shí)硫酸鹽還原效率最高（76.6%），其次是乳酸（67.3%）、乙醇（67.1%）、甲酸鹽（46.3%）和D-山梨糖醇（45.8%)，而其他則低于40%(圖1a)。硫酸鹽還原產(chǎn)物主要為硫化物，僅檢測(cè)到少量硫代硫酸鹽。SRB活動(dòng)可能與碳源的化學(xué)分類有關(guān)。總體而言，當(dāng)使用小分子糖作為碳源時(shí)，硫酸鹽去除效率非常低，約為25%(p=0.84)。結(jié)果表明，碳源代謝對(duì)pH的影響可能是不同碳源影響SRB活性的重要原因。從PCA圖中得知，當(dāng)用作碳源時(shí)，醇類和糖類表現(xiàn)出某些相似性。在這里，pH總是與硫化物呈正相關(guān)，與ORP呈負(fù)相關(guān)。綜上所述，不同碳源對(duì)微生物硫酸鹽還原的影響可分為兩個(gè)方面。一方面，SRB對(duì)不同的碳源有不同的親和力。另一方面，SRB的碳源代謝過(guò)程可能通過(guò)影響溶液的pH和ORP對(duì)SRB活性產(chǎn)生反饋。
圖1不同碳源條件下反應(yīng)前后各項(xiàng)指標(biāo)的變化。A、硫化合物的轉(zhuǎn)化效率。b、反應(yīng)前后的pH值。C、反應(yīng)結(jié)束時(shí)的ORP值。d、PCA雙序列圖。
微生物增殖速度最快的是在含乳酸鹽的環(huán)境中，其次是丙酸鹽和乙醇，甲酸鹽、乙酸鹽、葡萄糖和果糖中增殖速率較低（圖2a）。這表明SRB可以利用碳水化合物，但溶液的快速酸化會(huì)抑制反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)以乙醇、D-山梨糖醇、乳酸鹽和丙酸鹽為碳源時(shí)，隨著碳源濃度的增加，微生物生物量顯著增加（圖2b）。在此條件下，碳源濃度是制約微生物生長(zhǎng)的主要因素。甲酸鹽和乙酸鹽濃度的變化對(duì)生物量增長(zhǎng)的影響有限。此外，與使用丙酸鹽生長(zhǎng)的SRB相比，基于碳水化合物的SRB具有較低的生物量。微生物活性在丙酸鹽下最高（圖2c）。因此，較高的能量代謝活動(dòng)與使用丙酸鹽和較大生物質(zhì)的快速硫酸鹽還原有關(guān)。此外，碳水化合物環(huán)境中最低的ETSA，進(jìn)一步證明環(huán)境變化會(huì)嚴(yán)重抑制微生物活性
圖2微生物活性的變化。a,OD600表示的微生物生長(zhǎng)曲線(A-OC/T-OC=3)。b,CCK-8在不同碳源類型和濃度下檢測(cè)到的微生物數(shù)量。c，不同碳源條件下的ETSA（A-OC/T-OC=3）。
在理論碳源濃度下，硫酸鹽還原反應(yīng)基本不會(huì)發(fā)生。隨著碳源濃度的增加，硫酸鹽去除效率迅速增加。當(dāng)以乙醇和丙酸鹽為碳源時(shí)，僅當(dāng)碳源量為理論值的3倍時(shí)，硫酸鹽還原效率才達(dá)到85%以上。然而，當(dāng)使用甲酸鹽時(shí)，碳源的量只需為理論值的兩倍。在乙醇和丙酸鹽理論濃度的兩倍下，硫酸鹽還原率分別為39.1%和56.9%。這是因?yàn)楫?dāng)乙醇和丙酸鹽被用作碳源時(shí)，它們部分轉(zhuǎn)化為乙酸鹽，而乙酸鹽沒(méi)有被SRB作為電子供體充分利用，而甲酸鹽被充分利用乙酸鹽積累表明，盡管CO-SRB和IO-SRB共存，但I(xiàn)O-SRB顯然更容易生長(zhǎng)和增殖。
圖3三種碳源、四種濃度下SRB硫酸鹽還原過(guò)程中各指標(biāo)的變化。a,硫酸鹽濃度的變化。b,硫化物濃度的變化。c，一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)。
以乙醇為碳源，幾乎不產(chǎn)生CO2（圖4）。相反，當(dāng)使用丙酸鹽作為碳源時(shí)，隨著碳源濃度的增加，乙酸鹽和CO2的產(chǎn)量逐漸增加。這表明當(dāng)碳源充足時(shí)SRB在微生物群落中占主導(dǎo)地位，反應(yīng)接近理想的微生物硫酸鹽還原。在這項(xiàng)研究中，乙醇被充分利用后僅檢測(cè)到少量CO2，這可能是由于pH值降低，影響了溶液中CO2的存在形式。IO-SRB將乙醇不完全氧化為乙酸，導(dǎo)致水體酸化，而CO-SRB將甲酸鹽完全氧化為CO2，導(dǎo)致pH升高。IO-SRB以介于乙醇和甲酸鹽之間的方式利用丙酸鹽，從而使溶液的pH保持穩(wěn)定。
圖4不同碳源、不同碳源濃度條件下的碳源轉(zhuǎn)化（1、2、3、4對(duì)應(yīng)A-OC/TO-OC比值）。
各指標(biāo)計(jì)算的生物多樣性在不同有機(jī)質(zhì)類型下表現(xiàn)出顯著差異（p<0.05）。這表明碳源類型是控制微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因素，而碳源濃度是次要因素。來(lái)自丙酸鹽和乙醇處理的群落分別具有最低和最高的豐度，表明它們分別對(duì)微生物類群具有更多和更少的選擇性（圖5a）。直接使用社區(qū)中擴(kuò)增子序列變體的數(shù)量繪制的維恩圖展示了與alpha多樣性指標(biāo)相似的結(jié)果（圖5b）。基于Bray-Curtis距離矩陣的PCoA顯示樣品根據(jù)不同的碳源分布在三個(gè)不同的區(qū)域（圖5c）。同樣，這表明碳源類型是影響微生物硫酸鹽還原環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因素。
圖5微生物多樣性分析。a，微生物多樣性指數(shù)。b，維恩圖。c、PCoA分析圖（A、B、C分別代表乙醇、丙酸、甲酸）
A組（以乙醇為碳源）和B（以丙酸為碳源）組中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌家族分別是Desulfomicrobiaceae和Desulfovibrionaceae。Desulfomicrobiaceae和Desulfovibrionaceae科的大多數(shù)成員都是IO-SRB。隨著碳源濃度的增加，這些科的豐度呈上升趨勢(shì)。在A組中，Desulfomicrobiaceae的豐度從5.4%增加到32.8%，而在B組中，Desulfovibrionaceae的豐度從0.0%增加到23.4%。然而，在以甲酸鹽為碳源的C組（以甲酸鹽為碳源）中，IO-SRB豐度極低。相反，CO-SRB的Desulfuromonadaceae(2.7%–3.3%)和Desulfococcaceae(1.2%–2.1%)具有相對(duì)較高的豐度。結(jié)果表明，IO-SRB在乙醇和丙酸鹽中占優(yōu)勢(shì)，而CO-SRB在甲酸鹽中占優(yōu)勢(shì)。并且，CO-SRB競(jìng)爭(zhēng)力較差，不易占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。
圖6c顯示SRB的豐度與乙醇和丙酸鹽濃度之間呈正相關(guān)，但與甲酸鹽濃度無(wú)關(guān)此外，當(dāng)使用乙醇作為碳源時(shí)，多種非SRB與乙醇濃度呈正相關(guān)，表明多種微生物與SRB競(jìng)爭(zhēng)，可能導(dǎo)致硫酸鹽還原效率較低。Desulfovibrionaceae(IO-SRB)與丙酸鹽呈現(xiàn)著正相關(guān)，而Desulfuromonadaceae(CO-SRB)與丙酸鹽呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。該結(jié)果表明丙酸鹽對(duì)IO-SRB具有良好的選擇性。
圖6微生物群落結(jié)構(gòu)分析。a,科級(jí)物種組成條形圖。b，類水平微生物物種組成的弦圖。c，科級(jí)物種與碳源的相關(guān)熱圖（*相關(guān)，**顯著相關(guān)，***高度相關(guān)）。d,微生物繁殖網(wǎng)絡(luò)圖。（A、B、C分別代表乙醇、丙酸、甲酸；1、2、3代表濃度梯度）
結(jié)論
本研究調(diào)查了存在不同碳源（包括醇類、小分子有機(jī)酸和糖類）以及不同C/S情況下微生物硫酸鹽的還原。不同碳源轉(zhuǎn)化途徑的差異是影響硫酸鹽還原過(guò)程的主要因素。IO-SRB的存在導(dǎo)致糖類和醇類的快速和不完全氧化產(chǎn)生乙酸，同時(shí)通過(guò)降低溶液pH抑制SRB的活性。而pH值穩(wěn)定的小有機(jī)酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)生更多的硫化物。在所有測(cè)試的碳源中，使用丙酸鹽、乳酸、乙醇和甲酸鹽實(shí)現(xiàn)了更快的硫酸鹽還原，最佳C/S是化學(xué)計(jì)量比的三倍。碳源類型還通過(guò)塑造微生物群落來(lái)影響硫酸鹽還原。乙醇和丙酸鹽有利于IO-SRB（Desulfomicrobiaceae和Desulfovibrionaceae）的增殖，而CO-SRB（Desulfuromonadaceae和Desulfococccaceae）在甲酸鹽中占主導(dǎo)地位。IO-SRB一般生長(zhǎng)較快，能量代謝較高，但碳源利用效率較低。在不同的pH值下，硫化物從水中的去除方式不同。本研究為選擇微生物硫酸鹽還原的最佳碳源提供了依據(jù)，并為污水中硫酸鹽的去除和再利用提供了新的見(jiàn)解。
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