蘇云金芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)、吸光度變化曲線(xiàn)及最侍活化時(shí)間
通過(guò)對(duì)蘇云金芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的研究，將處于不同生長(zhǎng)階段的菌體分別作為菌種，進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，對(duì)610 nm和278 nm波長(zhǎng)處的吸光度變化曲線(xiàn)、溶氧變化曲線(xiàn)和p H值變化曲線(xiàn)進(jìn)行比較，得出了菌種最佳的活化時(shí)間為8 h，把處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體作為“種子”，與未活化的菌種發(fā)酵相比，可以使發(fā)酵周期由32 h縮短為28 h。
蘇云金芽孢桿菌(Bt)作為生物農(nóng)藥中的一種，以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)成為目前產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣的微生物殺蟲(chóng)劑，占到生物農(nóng)藥的80%左右。目前，蘇云金芽孢桿菌的菌種選育、基因工程等上游技術(shù)逐漸走向成熟。而要滿(mǎn)足市場(chǎng)的大量需求，發(fā)酵生產(chǎn)是關(guān)鍵。
近年來(lái)，人們通過(guò)改變培養(yǎng)方式、發(fā)酵方法和設(shè)計(jì)新的反應(yīng)器類(lèi)型等方法來(lái)達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)中高效發(fā)酵的目的，卻往往忽略了通過(guò)縮短發(fā)酵周期來(lái)提高發(fā)酵效率的方法。菌體的發(fā)酵周期除受培養(yǎng)基成分、發(fā)酵條件等影響外，菌種的活化時(shí)間也是影響發(fā)酵周期的關(guān)鍵因素。筆者系統(tǒng)研究了蘇云金芽孢桿菌菌種活化時(shí)間對(duì)發(fā)酵周期的影響，確定了最佳活化時(shí)間。
1材料和方法
1.1供試菌種
Bacillus thuringiensis HD-1。
1.2儀器和設(shè)備
數(shù)顯光照培養(yǎng)箱，高壓滅菌鍋，SW-CJ-FD型凈化工作臺(tái)，光照恒溫振蕩培養(yǎng)箱，GBCS-8C型發(fā)酵罐，752C紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)。
1.3培養(yǎng)基
1.3.1 LB固體培養(yǎng)基
胰蛋白胨:10 g/L，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠(chǎng)提供;酵母膏:5 g/L，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠(chǎng)提供;NaCl:10 g/L，北京益利化學(xué)品公司提供;瓊脂:15 g/L，北京化學(xué)試劑公司提供;p H值為7.2～7.3。
1.3.2自制培養(yǎng)基
玉米粉:15 g/L;豆餅粉:15 g/L;花生餅粉:12 g/L，購(gòu)于市場(chǎng);魚(yú)粉:5 g/L，北京飼料公司提供;淀粉:10 g/L，北京市恒利公司提供;K2HPO4:5 g/L，北京紅星化工廠(chǎng)提供;CaCO3:7 g/L，北京化學(xué)試劑公司提供;p H值為7.2～7.4。
1.4菌種制備
采用LB固體培養(yǎng)基配方發(fā)酵HD-1菌株，接種后36 h，向固體培養(yǎng)基上加入一定體積的無(wú)菌水，用手振蕩錐形瓶或用接種環(huán)輕輕刮拭瓊脂表面以洗落固體培養(yǎng)基表面的菌體，將菌懸液收集到一錐形瓶中，配置成菌懸液，冷凍保藏，備用。
1.5菌體生長(zhǎng)曲線(xiàn)確定
250 m L搖瓶，培養(yǎng)基裝量50 m L，共15瓶，滅菌后用其中14瓶接種，另外一瓶為空白。培養(yǎng)條件:30℃恒溫光照培養(yǎng)，240 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)，每隔1 h在610 nm處測(cè)定吸光度，得到菌體生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
1.6發(fā)酵罐試驗(yàn)
分別將等體積的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌懸液、等體積菌懸液接種自制培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h和培養(yǎng)13 h的菌體，接種于發(fā)酵罐中發(fā)酵，每隔2 h取樣，分別在278 nm和610 nm處測(cè)發(fā)酵液吸光度，比較發(fā)酵效果。
1.7參數(shù)測(cè)定方法
1.7.1吸光度變化曲線(xiàn)測(cè)定
利用發(fā)酵罐中取樣針每隔2 h取樣一次，取樣發(fā)酵液1 mL，用去離子水稀釋100倍，測(cè)其在278 nm和610 nm處的吸光度值，每種測(cè)5次取平均值，求出目標(biāo)產(chǎn)物的吸光度值并記錄。
2結(jié)果與討論
2.1蘇云金芽孢桿菌菌體生長(zhǎng)曲線(xiàn)
為確定蘇云金芽孢桿菌所處遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期等生長(zhǎng)時(shí)期的具體時(shí)間，制作了蘇云金芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖1。
可以看出，菌體在0～4 h生長(zhǎng)非常緩慢，稱(chēng)之為遲緩期，這主要是菌體適應(yīng)新培養(yǎng)基環(huán)境以及自身的萌發(fā)所需要的時(shí)間;在5～10 h吸光度值迅速增加，這說(shuō)明菌體總數(shù)迅速增加，成對(duì)數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，稱(chēng)之為對(duì)數(shù)期;10 h以后，吸光度變化已經(jīng)不明顯，這說(shuō)明菌體數(shù)增加維持穩(wěn)定。
工業(yè)上發(fā)酵周期是一個(gè)關(guān)鍵因素，如何降低發(fā)酵周期直接影響到發(fā)酵的效益。在工業(yè)發(fā)酵中，遲緩期會(huì)增加生產(chǎn)周期而產(chǎn)生不利的影響。因此，可以利用對(duì)數(shù)期的細(xì)胞作為“種子”，接種前后所使用的培養(yǎng)基組分不要相差太大，以避免適應(yīng)新培養(yǎng)基環(huán)境所需時(shí)間，從而縮短發(fā)酵周期。
2.2 610 nm處吸光度曲線(xiàn)比較
對(duì)于蘇云金芽孢桿菌菌來(lái)說(shuō)，在610 nm處吸光度最大，因此用發(fā)酵液610 nm處吸光度變化曲線(xiàn)來(lái)表征菌體生長(zhǎng)變化曲線(xiàn)。對(duì)于3種不同活化時(shí)間的菌種，接種后發(fā)酵液在610 nm處的吸光度變化曲線(xiàn)如圖2所示，測(cè)量方法見(jiàn)1.7.1。
圖1蘇云金芽孢桿菌菌體生長(zhǎng)曲線(xiàn)
可以看出，對(duì)于用未活化的菌體作為菌種發(fā)酵時(shí)，在接種6 h時(shí)間內(nèi)，吸光度變化比較緩慢，說(shuō)明在此階段還沒(méi)有大量繁殖，處于群體生長(zhǎng)規(guī)律中的遲緩期。這是由于把固體培養(yǎng)的菌體直接作為菌種，接種前后培養(yǎng)基成分差別較大，芽孢需要適應(yīng)新環(huán)境，暫時(shí)缺少足夠的能量和必需的生長(zhǎng)因子，導(dǎo)致了遲緩期的形成。隨后進(jìn)入生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，此階段大概持續(xù)了10 h，對(duì)數(shù)期持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)發(fā)酵越有利。在16～32 h進(jìn)入穩(wěn)定期，隨后進(jìn)入衰亡期。活化8 h菌種發(fā)酵相對(duì)于未活化的菌種發(fā)酵來(lái)說(shuō)，遲緩期明顯縮短或不存在，這主要是因?yàn)榫N已在相同成分的培養(yǎng)基中得到活化，已經(jīng)到達(dá)了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段，接種于發(fā)酵罐后前后培養(yǎng)基成分無(wú)明顯差別，使菌體不需要重新適應(yīng)環(huán)境，可以使對(duì)數(shù)生長(zhǎng)得到繼續(xù)。從活化8 h的菌種發(fā)酵中可以看出，在4～14 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14～30 h處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期。菌種經(jīng)過(guò)活化13 h后菌體已處于生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，此時(shí)接種于發(fā)酵罐中，與活化8 h的菌種發(fā)酵相比較，610 nm處吸光度曲線(xiàn)除初始吸光度稍有增加外，無(wú)明顯變化。
從以上分析可以看出，將在相同培養(yǎng)基成分中活化8 h的菌體作為菌種，可使蘇云金芽孢桿菌的遲緩期時(shí)間縮短4 h左右，而菌體穩(wěn)定期持續(xù)的時(shí)間無(wú)明顯變化。
2.3 278 nm處吸光度曲線(xiàn)比較
圖2活化時(shí)間對(duì)發(fā)酵液610 nm處吸光度的影響
經(jīng)測(cè)量，目標(biāo)產(chǎn)物(伴胞晶體和芽孢混合物)在278 nm處吸光度最大，因此發(fā)酵液在278 nm處吸光度變化曲線(xiàn)可以表征目標(biāo)產(chǎn)物的變化曲線(xiàn)。對(duì)于3種不同活化時(shí)間的菌種，接種后發(fā)酵液在278 nm處的吸光度變化曲線(xiàn)如圖3所示，測(cè)量方法見(jiàn)1.7.1。
未經(jīng)活化的菌種發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵液在278 nm處的吸光度在前10 h變化不明顯，說(shuō)明目標(biāo)產(chǎn)物還未大量形成、釋放。隨著菌體的大量繁殖，進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，此階段吸光度開(kāi)始增加，表明伴孢晶體和芽孢開(kāi)始大量形成并釋放。隨后菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，但目標(biāo)產(chǎn)物的吸光度仍然增加，說(shuō)明芽孢囊仍然不斷破裂，釋放出伴孢晶體，伴孢晶體的總量不斷增加。在36 h處達(dá)到最大值，相對(duì)穩(wěn)定5 h后，吸光度開(kāi)始下降。而經(jīng)活化8 h的菌種接種，在發(fā)酵32 h后發(fā)酵液278 nm處吸光度達(dá)到最大值，相對(duì)未活化的菌體作為菌種來(lái)說(shuō)，吸光度提前4 h達(dá)到最大值。從圖3可以看出活化8 h和活化13 h的菌體作為菌種發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵液在278 nm處的吸光度曲線(xiàn)無(wú)明顯變化。這說(shuō)明并不是活化時(shí)間越長(zhǎng)，目標(biāo)產(chǎn)物的量越多，這與菌種所處的生長(zhǎng)階段有關(guān)。
從上面比較中看出，未活化菌種接種和經(jīng)活化的菌體接種培養(yǎng)，目標(biāo)產(chǎn)物達(dá)到最大值的時(shí)間前者比后者提前4 h，這主要是由于經(jīng)活化8 h的菌種使生長(zhǎng)的遲緩期縮短或消失所造成的。
2.4溶氧量變化曲線(xiàn)比較
對(duì)于3種不同活化時(shí)間的菌種接種后，發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液溶氧量變化曲線(xiàn)見(jiàn)圖4，測(cè)量方法見(jiàn)1.7.2。
溶氧曲線(xiàn)從側(cè)面也能反應(yīng)出菌體的生長(zhǎng)過(guò)程，菌體生長(zhǎng)越快，所需氧氣量越大，發(fā)酵液中的溶氧量就越低。圖4中用未經(jīng)活化菌種發(fā)酵時(shí)，溶氧最低點(diǎn)出現(xiàn)在菌體生長(zhǎng)15～20 h的對(duì)數(shù)期，說(shuō)明此時(shí)菌體增長(zhǎng)率最高、新陳代謝最活躍。活化8 h和活化13 h的菌種發(fā)酵時(shí)，溶氧量最低點(diǎn)都出現(xiàn)在12 h，說(shuō)明其最快增長(zhǎng)期比用未活化的菌種發(fā)酵提前3 h。針對(duì)出現(xiàn)溶氧最低點(diǎn)的時(shí)刻，生產(chǎn)中可以在溶氧最低點(diǎn)時(shí)刻提高供氧量和補(bǔ)料，從而延長(zhǎng)菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或出現(xiàn)第2對(duì)數(shù)期，達(dá)到高效發(fā)酵的目的。
圖3活化時(shí)間對(duì)發(fā)酵液278 nm處吸光度的影響
綜上，將3種不同活化時(shí)間菌種發(fā)酵的各參數(shù)最大(小)值及到達(dá)最大(小)值處的時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見(jiàn)表1。從表1中可以看出，菌種的不同培養(yǎng)時(shí)間直接影響發(fā)酵的過(guò)程和周期。用未活化的菌體直接接種固體培養(yǎng)和用經(jīng)過(guò)活化8 h的菌體作為菌種接種時(shí)，菌數(shù)(610 nm處吸光度)和目標(biāo)產(chǎn)物(278 nm處吸光度)到達(dá)最大值時(shí)前者要比后者晚4 h，而菌體活化8 h和活化13 h后接種出現(xiàn)最大值處的時(shí)間沒(méi)有明顯變化。因此比較可知，菌體活化8 h后接種為最佳的活化時(shí)間，這樣可使發(fā)酵周期提前4 h，而所獲得的目標(biāo)產(chǎn)物的量基本不變。
3結(jié)語(yǔ)
利用處于對(duì)數(shù)期的菌體作為“種子”，并且盡量使接種前后所使用的培養(yǎng)基組分不要相差太大，能夠使蘇云金芽孢桿菌的發(fā)酵周期縮短4 h(由原來(lái)的32 h縮短為28 h)，從而提高生產(chǎn)效率。
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