煙曲霉生長(zhǎng)曲線變化與致死溫度研究
侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis，IA)是一種嚴(yán)重威脅生命的疾病，在白血病和骨髓移植受者等免疫受損機(jī)體中病死率超過90%。煙曲霉是引起IA的最主要致病菌，約占90%，目前其對(duì)人體的致病機(jī)制尚不清楚。無論是在外界環(huán)境中還是進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，煙曲霉都面臨生存環(huán)境的變化，這些變化統(tǒng)稱為應(yīng)激，其中生存環(huán)境溫度的變化是煙曲霉面臨的最基本的應(yīng)激。溫度是影響微生物生長(zhǎng)的重要因素之一，不同物種對(duì)環(huán)境溫度變化具有不同的適應(yīng)能力。
煙曲霉是什么菌？
煙曲霉被認(rèn)為是一種耐熱真菌，這種特性使其對(duì)環(huán)境變化的抵抗力更強(qiáng)。有研究發(fā)現(xiàn)，在30～42℃間，煙曲霉都能較好的生長(zhǎng)，此外，在對(duì)肥料發(fā)酵的研究中發(fā)現(xiàn)，煙曲霉能抵御60～80℃高溫。但是，對(duì)于煙曲霉耐受高溫的程度在以往研究中并沒有確切的描述。
本研究通過測(cè)定煙曲霉在不同溫度下的生長(zhǎng)曲線及其在更高溫度下的存活率，確定煙曲霉的最適生長(zhǎng)溫度、最高生長(zhǎng)溫度及致死溫度，從而對(duì)煙曲霉耐高溫生長(zhǎng)的生理學(xué)特性有更準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)。
絲狀真菌的生長(zhǎng)可分為5個(gè)階段，分別是靜止期、第一過渡期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、第二過渡期及穩(wěn)定期。在第一過渡期時(shí)，孢子開始腫脹發(fā)芽，但菌絲延長(zhǎng)不明顯，生長(zhǎng)曲線較平滑，表現(xiàn)出緩慢上升趨勢(shì);當(dāng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度最快，生長(zhǎng)曲線達(dá)到最大斜率;當(dāng)處于第二過渡期時(shí)，菌絲延伸速度下降，生長(zhǎng)曲線斜率下降，再次變得平滑。生長(zhǎng)曲線能夠直觀的反映出絲狀真菌的生長(zhǎng)情況，因此，我們應(yīng)用生長(zhǎng)曲線法評(píng)價(jià)煙曲霉的生長(zhǎng)狀況。我們選用了三種研究曲霉生理特性時(shí)較常用的培養(yǎng)基:YG培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，除了必需成分外，還含有微量元素和維生素，特別利于菌株生長(zhǎng);MM培養(yǎng)基成分與察氏培養(yǎng)基類似，但嚴(yán)格限定了pH值，在研究不同營(yíng)養(yǎng)成分、不同酸堿環(huán)境對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響時(shí)可以精確改變營(yíng)養(yǎng)條件;YNB培養(yǎng)基中無碳源，可以用來研究菌株對(duì)不同碳源的利用情況。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，相同溫度下，YG培養(yǎng)基中測(cè)得的生長(zhǎng)曲線能更完整的反映出煙曲霉的生長(zhǎng)周期，最適宜用來觀察溫度對(duì)煙曲霉生長(zhǎng)的影響。
圖1兩株煙曲霉菌株在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(MM.曲霉基礎(chǔ)培養(yǎng)基，YNB.酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基，YG.酵母浸膏培養(yǎng)基)圖2煙曲霉在不同溫度下的生長(zhǎng)曲線:a.AF293，b.DAL圖3兩株煙曲霉菌株在高溫下的活力曲線
雖然研究普遍認(rèn)為煙曲霉是一種耐熱真菌，但對(duì)其耐受高溫的程度，并沒有確切的描述。我們發(fā)現(xiàn)，在YG培養(yǎng)基中，煙曲霉的最適宜生長(zhǎng)溫度為37℃，在此溫度下其生長(zhǎng)最好。這也是煙曲霉容易感染人體的一個(gè)重要原因。當(dāng)溫度達(dá)到48℃時(shí)，煙曲霉的生長(zhǎng)受到一定程度的抑制，但在不同菌株中情況并不完全一致:在AF293中觀察到，菌株的生長(zhǎng)受到明顯的抑制，第一生長(zhǎng)過渡期延長(zhǎng)，菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間延長(zhǎng)，生長(zhǎng)曲線斜率較37℃明顯下降;而在DAL中卻觀察到，雖然菌株第一生長(zhǎng)過渡期延長(zhǎng)，但進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，菌株的生長(zhǎng)并未減緩。當(dāng)溫度達(dá)到52℃時(shí)，兩株煙曲霉菌株均表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)受抑，生長(zhǎng)曲線斜率最小。以往關(guān)于真菌對(duì)溫度耐受的研究中，多集中于30℃到37℃或42℃的溫度改變引起的轉(zhuǎn)錄水平或蛋白水平的變化。由于煙曲霉是一種耐熱真菌，研究發(fā)現(xiàn)30～37℃的溫度改變不足以引起其與毒力相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生改變。因此，其后對(duì)煙曲霉熱休克反應(yīng)的研究多將刺激溫度選為48℃［13-14］。但是我們發(fā)現(xiàn)，煙曲霉菌株在48℃時(shí)仍具有良好的生長(zhǎng)能力，并且不同的菌株對(duì)48℃的反應(yīng)不完全一致;當(dāng)溫度達(dá)到52℃時(shí)，兩株煙曲霉才表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)受抑。該結(jié)果提示，在煙曲霉對(duì)高溫耐受的研究中，應(yīng)該選擇52℃作為刺激條件。
既往研究認(rèn)為煙曲霉能夠耐受肥堆的高溫發(fā)酵階段，但其致死溫度不清楚。因此，本研究還測(cè)定了煙曲霉菌株的致死溫度;致死溫度指一定條件下和一定時(shí)間內(nèi)殺死微生物的最低溫度。我們發(fā)現(xiàn)，65℃持續(xù)刺激180 min或70℃刺激120 min可完全殺死煙曲霉。由于高于70℃的溫度會(huì)使固體培養(yǎng)基熔化，因此我們無法得到高于70℃時(shí)煙曲霉的致死條件。這有待于在將來的研究中改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法以闡明。
本研究中得到的煙曲霉最適生長(zhǎng)溫度、最高生長(zhǎng)溫度及致死溫度雖然具有一定的代表性，但仍需在未來研究中擴(kuò)大樣本量以驗(yàn)證;我們的結(jié)果也提示，無論是以標(biāo)準(zhǔn)菌株還是臨床菌株為研究對(duì)象，都需要預(yù)先了解該菌株的生理特性，以合理選擇實(shí)驗(yàn)條件。
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