快速藥敏檢測(cè)方法、發(fā)展現(xiàn)狀|拉曼光譜在RAST領(lǐng)域中的應(yīng)用（一）
細(xì)菌感染每年導(dǎo)致全球800多萬人死亡,占所有報(bào)告的與感染有關(guān)的死亡人數(shù)的50%以上。在得到準(zhǔn)確的藥敏結(jié)果前,30%～50%的細(xì)菌感染患者接受的一線抗菌藥物治療無效,而且每延遲1 h給予正確的抗菌藥物治療,患者的存活率就會(huì)下降10%。為了縮短藥敏檢測(cè)時(shí)間,各種快速藥敏檢測(cè)(RAST)方法被開發(fā)出來,如基于光學(xué)、電阻抗、微流控、質(zhì)譜及拉曼光譜等原理的技術(shù),這些技術(shù)主要是基于細(xì)菌生長(zhǎng)或代謝表型的藥敏檢測(cè)。但由于不同細(xì)菌繁殖速度存在差異,基于細(xì)菌生長(zhǎng)的技術(shù)可能受限,在抗菌藥物作用下,細(xì)菌代謝表型的變化會(huì)更快。以細(xì)菌代謝表型檢測(cè)為目的的基于拉曼光譜的藥敏檢測(cè)技術(shù)已被證明是有前途的RAST替代方案。本文分析細(xì)菌耐藥性的流行病學(xué)現(xiàn)狀和RAST發(fā)展現(xiàn)狀,進(jìn)一步討論基于細(xì)菌代謝表型檢測(cè)的拉曼光譜在RAST方面的研究進(jìn)展,為RAST的研究提供新思路。
1 快速藥敏檢測(cè)方法原理
1.1基于光學(xué)原理的RAST方法
ZHANG等通過大體積溶液散射成像(LVSI)系統(tǒng)直接對(duì)臨床尿液標(biāo)本成像,并使用單細(xì)胞分裂跟蹤方法分析尿液病原菌圖像,在60 min內(nèi)就得到了藥敏結(jié)果,與金標(biāo)準(zhǔn)藥敏結(jié)果完全一致。CANSIZOGLU等開發(fā)了一種快速超靈敏探測(cè)器(RUSD)藥敏檢測(cè)平臺(tái),可以檢測(cè)到極低細(xì)胞密度的細(xì)菌,在2～4 h內(nèi)可測(cè)得常用抗菌藥物對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌的最低抑制濃度(MIC)。
1.2基于電阻抗原理的RAST方法
HANNAH等用瓊脂糖基水凝膠沉積物修飾絲網(wǎng)印刷電極,將敏感和耐藥的金黃色葡萄球菌菌株置于含有抗菌藥物的電極上,利用電化學(xué)阻抗譜(EIS)和差分脈沖伏安法(DPV)監(jiān)測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)并建立生長(zhǎng)曲線,在45 min內(nèi)即可區(qū)分敏感菌和耐藥菌。PITRUZZELLO等基于電阻抗可直接檢測(cè)活細(xì)菌代謝的原理,研究抗菌藥物處理下單個(gè)細(xì)菌的電反應(yīng),可在30～60 min內(nèi)測(cè)得藥敏結(jié)果。
1.3基于微流控技術(shù)的RAST方法
LI等開發(fā)了一種在單細(xì)胞水平進(jìn)行快速病原體分類和藥敏試驗(yàn)的適應(yīng)性微流控系統(tǒng),通過結(jié)合可調(diào)微流體閥和實(shí)時(shí)光學(xué)檢測(cè),細(xì)菌被捕獲并根據(jù)其物理特征進(jìn)行分類,在單細(xì)胞水平監(jiān)測(cè)它們?cè)诳咕幬镒饔孟碌纳L(zhǎng),最短30 min就可以確定細(xì)菌的耐藥性。KANDAVALLI等也提出了一種在微流控芯片中基于單細(xì)胞水平的藥敏檢測(cè)方法,該研究使用4種抗菌藥物和7種細(xì)菌的混合標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),可在2 h內(nèi)確定混合標(biāo)本中各種細(xì)菌的藥敏譜。
1.4其他RAST方法
ZHANG等通過核苷酸膠體染料(SYBR GreenⅠ)和碘化丙啶(PI)染色,在30～60 min內(nèi)檢測(cè)到100株肺炎克雷伯菌臨床分離菌株對(duì)4種不同抗菌藥物的耐藥性。KLLAI等提出了一種基于流式細(xì)胞術(shù)的RAST方法,在培養(yǎng)4 h后就能觀察到細(xì)菌的生長(zhǎng),藥敏結(jié)果的準(zhǔn)確率在87%以上。LI等采用基質(zhì)輔助激光解吸/電離時(shí)間飛行質(zhì)譜法(MALDI-TOF MS)檢測(cè)了大腸埃希菌在有無黏菌素條件下的生長(zhǎng)狀況,大腸埃希菌與抗菌藥物孵育2 h后,根據(jù)敏感株和耐藥株之間的相對(duì)生長(zhǎng)值測(cè)定了黏菌素的MIC。YANG等以肺炎克雷伯菌和環(huán)丙沙星為細(xì)菌-抗生素模型,采用RNA測(cè)序技術(shù)確定了細(xì)菌暴露于抗菌藥物后的RNA標(biāo)志物用于藥敏檢測(cè),肺炎克雷伯菌暴露于環(huán)丙沙星10 min就可檢測(cè)到RNA標(biāo)志物的變化,然后通過實(shí)時(shí)定量PCR在11株肺炎克雷伯菌分離株中進(jìn)行驗(yàn)證,準(zhǔn)確度良好。
2拉曼光譜的基本原理及優(yōu)勢(shì)
拉曼光譜基于非彈性散射原理,是一種非侵入性光譜技術(shù),可用于分子表征和成像,具有高空間分辨率。在生物學(xué)中,它特別適用于生物分子的鑒定和細(xì)胞的光譜特征分析。傳統(tǒng)的拉曼光譜信號(hào)強(qiáng)度低、抗干擾能力弱,檢測(cè)時(shí)需要較長(zhǎng)的積分時(shí)間,限制了其在RAST中的應(yīng)用。
表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)相比于自發(fā)拉曼光譜,有高靈敏度的優(yōu)點(diǎn),其基于離域電子集體相干振蕩導(dǎo)致的激光與電磁場(chǎng)耦合,在金屬納米結(jié)構(gòu)之間的間隙連接處或納米間隙處通過局部表面等離子體共振產(chǎn)生“熱點(diǎn)”,從而產(chǎn)生強(qiáng)大的局部電磁場(chǎng)聚焦增強(qiáng),可以將吸附在金或銀納米粒子上分子的拉曼信號(hào)增強(qiáng)1010～1014倍。
共聚焦拉曼光譜(CRS)能有效消除焦平面外的信號(hào)干擾,其空間分辨率、信噪比、精度等性能均高于普通拉曼光譜,它與顯微技術(shù)聯(lián)用,結(jié)合可移動(dòng)的掃描平臺(tái),可在三維空間中精確定位樣品和成像。受激拉曼光譜(SRS)是一種無損的、無標(biāo)記的振動(dòng)光譜學(xué)方法,通過相干激發(fā)分子鍵振動(dòng)并保留光譜指紋,克服了傳統(tǒng)的自發(fā)拉曼散射固有缺點(diǎn),可實(shí)現(xiàn)高速、高化學(xué)特異檢測(cè)。此外,SRS成像比傳統(tǒng)自發(fā)拉曼成像速度快1 000倍以上,且不受樣品自發(fā)熒光干擾。
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