空腸彎曲菌噬菌體生物學(xué)特性測(cè)定及生長(zhǎng)曲線繪制（三）
2.5噬菌體vB_Cj_QDYZ功能注釋
噬菌體vB_Cj_QDYZ全基因組的功能注釋如圖3所示，全基因組一共有165個(gè)ORF，3個(gè)tRNA。其中有65個(gè)ORF編碼已知功能，另外100個(gè)編碼假設(shè)蛋白。對(duì)65個(gè)具有已知功能的ORF分類，主要有4種功能的蛋白:噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白、裂解蛋白、包裝蛋白、與噬菌體復(fù)制和代謝有關(guān)的蛋白。具體的注釋結(jié)果見(jiàn)附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035791)。
圖3噬菌體vB_Cj_QDYZ基因組功能注釋
噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白有:ORF10(主要衣殼蛋白)，ORF131(衣殼組裝蛋白)，ORF11和ORF34(頭部完成蛋白)，ORF133(頸部蛋白)，ORF13和ORF167(尾鞘穩(wěn)定劑和完成蛋白)，ORF90、ORF91和ORF136(尾管蛋白)，ORF113(尾鞘蛋白)，ORF100(尾絲蛋白)。其中，尾管蛋白是噬菌體編碼尾部的蛋白，與吸附宿主菌密切相關(guān)。尾絲蛋白是噬菌體特異性識(shí)別宿主的物質(zhì)基礎(chǔ)，噬菌體的尾絲蛋白在特定微生物檢測(cè)凈化等方面具有重要意義。
噬菌體裂解相關(guān)蛋白有2個(gè):ORF66(內(nèi)溶素)和ORF85(尾部溶菌酶)。噬菌體可能是通過(guò)表達(dá)這兩種蛋白來(lái)裂解宿主菌的。
噬菌體包裝蛋白:ORF107(末端酶大亞基)，ORF134(末端酶小亞基)。噬菌體包裝蛋白主要在噬菌體包裝時(shí)起重要作用。其他蛋白包括受體結(jié)合蛋白:ORF1、ORF2、ORF3、ORF4，與噬菌體結(jié)合細(xì)菌表面受體相關(guān)。
與噬菌體復(fù)制和代謝有關(guān)的蛋白有:ORF6、7(重組核酸內(nèi)切酶)，ORF8(轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子)，ORF37(RNA連接酶)，ORF48(聚合酶)，ORF55(重組和修復(fù)蛋白)，ORF63(脫氫酶)，ORF68(拓?fù)洚悩?gòu)酶)，ORF97(氨基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白)，ORF101(核糖核酸酶)，ORF158(DNA聚合酶)，ORF162(胸苷激酶)，ORF164(DNA引物酶亞基)，ORF12、ORF54和ORF87(歸巢核酸內(nèi)切酶)，ORF71、ORF144和ORF145(解旋酶)，ORF61(dUTP焦磷酸酶)，ORF153(核酸外切酶)。其中，重組和修復(fù)蛋白的功能是將噬菌體基因組整合到宿主菌上。歸巢核酸內(nèi)切酶參與DNA內(nèi)含子的水平轉(zhuǎn)移和基因表達(dá)的調(diào)控。解旋酶是一類解開(kāi)氫鍵的酶，一般在噬菌體DNA復(fù)制過(guò)程中起到催化雙鏈DNA解旋的作用。焦磷酸酶，參與DNA合成。核酸外切酶，具有從分子鏈的末端順次水解磷酸二酯鍵而生成單核苷酸作用的酶。
2.6噬菌體vB_Cj_QDYZ比較基因組分析
噬菌體vB_Cj_QDYZ與空腸彎曲菌噬菌體CP39、CJLB-10、CP30A、CPX、CP8的同源性分別為98.30%、94.77%、94.61%、97.69%、97.82%，比對(duì)覆蓋率分別為95%、91%、92%、92%、92%。彎曲菌噬菌體分為2個(gè)屬Fletchervirus和Firehammervirus。與vB_Cj_QDYZ相似度最高的噬菌體來(lái)自Eucampyvirinae亞科，F(xiàn)letchervirus屬。初步推測(cè)空腸彎曲菌噬菌體vB_Cj_QDYZ可能是來(lái)自Eucampyvirinae亞科，F(xiàn)letchervirus屬的新成員。
2.7噬菌體vB_Cj_QDYZ系統(tǒng)進(jìn)化分析
如圖4-A所示，基于全基因組序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，噬菌體vB_Cj_QDYZ與CampylobacterphageCP39具有最近的親緣關(guān)系。NCBI檢索發(fā)現(xiàn)，CampylobacterphageCP39是Eucampyvirinae亞科、Fletchervirus屬的成員。研究表明CP39是肌尾噬菌體。因此推測(cè)vB_Cj_QDYZ是肌尾噬菌體(Myoviridae)科、Eucampyvirinae亞科、Fletchervirus屬的成員。
A-基于全基因組構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù);B-基于內(nèi)溶素序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù);C-基于主要衣殼蛋白構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)
圖4噬菌體vB_Cj_QDYZ進(jìn)化關(guān)系分析
如圖4-B所示，噬菌體vB_Cj_QDYZ的內(nèi)溶素和CampylobacterphageCPX的內(nèi)溶素相似度最高;如圖4-C所示，vB_Cj_QDYZ的主要衣殼蛋白與CampylobacterphageCP39的最相近。標(biāo)尺代表遺傳距離，遺傳距離越短代表親緣關(guān)系越近。明顯看出，圖4-B和圖4-C的進(jìn)化樹(shù)標(biāo)尺較長(zhǎng)，遺傳距離較大。因此推斷噬菌體vB_Cj_QDYZ可能為一株新的空腸彎曲菌噬菌體。
2.8噬菌體在牛奶中的抑菌效果
如圖5所示，加入空腸彎曲菌噬菌體vB_Cj_QDYZ后，在正常環(huán)境下放置4 h后，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定，哥倫比亞血平板上的空腸彎曲菌菌落總數(shù)從初始的1.0×107CFU/mL降低至1.17×105CFU/mL，降低了2個(gè)lg CFU/mL，充分說(shuō)明噬菌體vB_Cj_QDYZ在牛奶中的殺菌率為99%。牛奶是容易被彎曲菌污染的食品，選擇牛奶作為研究對(duì)象具有實(shí)際參考價(jià)值。綜上所述，噬菌體vB_Cj_QDYZ具有良好的抗菌潛力。
圖5噬菌體vB_Cj_QDYZ在牛奶中的抑菌效果
3結(jié)論與討論
本研究以空腸彎曲菌2206為宿主菌，從雞糞中分離出一株空腸彎曲菌噬菌體，將其命名為vB_Cj_QDYZ。噬菌體在雙層平板上可形成清晰透亮的噬菌斑，這說(shuō)明噬菌體具有很強(qiáng)的裂解能力。透射電鏡形態(tài)表明，噬菌體有一個(gè)正二十面體的頭部(直徑約100.81 nm)和一條可伸縮的尾部(長(zhǎng)度約65.90 nm)，具有彎曲菌噬菌體典型的終端泡和空頭結(jié)構(gòu)，屬于有尾噬菌體目，肌尾噬菌體科。大多數(shù)彎曲菌噬菌體屬于肌尾噬菌體。
生物學(xué)特性結(jié)果顯示，噬菌體具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，表現(xiàn)出噬菌體在某些惡劣環(huán)境下具有一定的適用性。噬菌體vB_Cj_QDYZ在30～60℃，pH值為3～12的環(huán)境下效價(jià)較穩(wěn)定，這為噬菌體在實(shí)際家禽生產(chǎn)中的防控提供了理論依據(jù)。空腸彎曲菌主要寄居在雞等家禽的腸道中，雞的正常體溫是39.6～43.6℃，雞腸道的pH值主要為2～4，這說(shuō)明噬菌體vB_Cj_QDYZ可以在雞的腸道中存活且保持較高效價(jià)，具有廣泛的應(yīng)用范圍。噬菌體vB_Cj_QDYZ的最佳感染復(fù)數(shù)為0.01，充分表明了噬菌體的侵染能力較強(qiáng)。一步生長(zhǎng)曲線表明，噬菌體的潛伏期是60 min，裂解期是150 min，爆發(fā)量是45 PFU/cell。因此，空腸彎曲菌噬菌體vB_Cj_QDYZ具有較短的潛伏期和較強(qiáng)的裂解能力。此外，加入不同感染復(fù)數(shù)的噬菌體顯著抑制了空腸彎曲菌的生長(zhǎng)，表現(xiàn)出噬菌體vB_Cj_QDYZ具有很強(qiáng)的裂解能力。噬菌體vB_Cj_QDYZ在牛奶中的殺菌率為99%，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值較高，具有開(kāi)發(fā)為新型空腸彎曲菌抗菌劑的潛力。
基因組學(xué)研究有利于從基因水平更深入了解空腸彎曲菌噬菌體。噬菌體vB_Cj_QDYZ基因組為雙鏈DNA，基因組全長(zhǎng)為130 627 bp，G+C含量為26%。基因組大小位于130～140 kbp，根據(jù)ICTV對(duì)彎曲菌噬菌體的最新分類，噬菌體vB_Cj_QDYZ被命名為CP8 virus，且屬于Ⅲ組噬菌體，特異性受體是莢膜多糖，對(duì)空腸彎曲菌具有較強(qiáng)的裂解性能。Ⅲ組噬菌體是目前抑菌效果最好的空腸彎曲菌噬菌體。噬菌體一共有165個(gè)ORF，3個(gè)tRNA。其中65個(gè)ORF具有功能。此外，以全基因組序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)顯示，噬菌體vB_Cj_QDYZ與CampylobacterphageCP39具有最近的親緣關(guān)系以主要衣殼蛋白和內(nèi)溶素序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)表明，噬菌體與其他的空腸彎曲菌噬菌體遺傳距離較遠(yuǎn)，推斷噬菌體vB_Cj_QDYZ屬于Fletchervirus屬的新成員。此外，噬菌體vB_Cj_QDYZ不含有抗生素耐藥基因、毒力基因、過(guò)敏原基因等，安全性較高，適合于實(shí)際應(yīng)用生產(chǎn)。
本研究分離純化一株裂解能力較強(qiáng)、穩(wěn)定性良好、安全性較高的新型空腸彎曲菌噬菌體，能夠有效抑制空腸彎曲菌的生長(zhǎng)，且特異性較強(qiáng)，具有開(kāi)發(fā)為新型空腸彎曲菌抗菌劑的潛力，豐富了空腸彎曲菌噬菌體的資源，為防治空腸彎曲菌污染提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。
相關(guān)新聞推薦
1、共生微生物調(diào)控TOR信號(hào)通路影響昆蟲脂質(zhì)代謝（一）
2、苦蕎蛋白對(duì)腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)抑制作用及機(jī)理（二）
3、龍腦精油3種組分對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的抑制效果——摘要