Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的毒性作用（一）
重金屬污染一直受到國(guó)際、國(guó)內(nèi)社會(huì)的高度關(guān)注。重金屬沿著食物鏈，通過(guò)生物積累對(duì)生物體造成嚴(yán)重的健康威脅。我國(guó)南方地區(qū)有色金屬開采和冶煉活動(dòng)的快速擴(kuò)張導(dǎo)致鎘、銅及其他金屬污染嚴(yán)重，其中稻田鎘污染導(dǎo)致稻米中鎘含量超過(guò)食品安全標(biāo)準(zhǔn)限值。不同重金屬種類、有效性、存在形態(tài)及含量對(duì)生物體產(chǎn)生的毒害效果不同。大多數(shù)金屬陽(yáng)離子會(huì)與蛋白質(zhì)有效絡(luò)合，從而形成不同的金屬離子-有機(jī)絡(luò)合物，而目前有關(guān)金屬和其他物質(zhì)聯(lián)合暴露對(duì)生物體的毒性研究較為匱乏。因此探究重金屬與其他物質(zhì)聯(lián)合暴露對(duì)生物體的毒性，可以更好地了解重金屬對(duì)生物體的毒性行為。
蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，其分泌的結(jié)晶蛋白（如Cry1Ab和Cry1Ac）可通過(guò)復(fù)雜的毒性機(jī)制控制鱗翅目昆蟲。Bt轉(zhuǎn)基因作物被大規(guī)模商業(yè)化推廣種植，從而導(dǎo)致大量Bt毒素蛋白通過(guò)植物根系分泌、秸稈還田和花粉飄落的方式進(jìn)入土壤和水生生態(tài)系統(tǒng)，Bt蛋白進(jìn)入土壤初期會(huì)對(duì)土壤酶活性產(chǎn)生影響。研究表明Bt毒素進(jìn)入土壤環(huán)境后會(huì)與其他污染物，如殺蟲劑、抗生素、重金屬等相互結(jié)合。Bt蛋白因富含酸性氨基酸結(jié)構(gòu)而具有較強(qiáng)的金屬絡(luò)合能力，其傾向與過(guò)渡金屬離子形成復(fù)合物，目前關(guān)于Bt抗蟲蛋白和重金屬聯(lián)合暴露對(duì)微生物的毒理作用研究較少。因此，評(píng)估兩者聯(lián)合暴露對(duì)微生物活性的影響具有重要意義。
本研究以Cry1Ac蛋白作為Bt蛋白代表，以Zn2+、Cd2+作為重金屬代表，以大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為受試模式生物，分析Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)兩種細(xì)菌的毒性作用，以期為重金屬與Bt毒素聯(lián)合暴露對(duì)微生物的生態(tài)安全風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行有效評(píng)估。
1材料與方法
1.1菌種及培養(yǎng)基配制
1.1.1菌種來(lái)源
大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Ba?cillus subtilis）由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供；發(fā)光細(xì)菌為費(fèi)氏弧菌（Vibrio fischeri），購(gòu)自浙江清華長(zhǎng)三角研究院。
1.1.2 LB培養(yǎng)基
液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、超純水1 L、121℃滅菌25 min。
固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、超純水1 L、加入1.5%瓊脂、121℃滅菌25 min。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)
將1 mL不同濃度的Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白單一及復(fù)合體系分別與1 mL菌懸液和8 mL液體培養(yǎng)基混合，最終Zn2+濃度為2、4、8、12、16、20μg?mL-1，Cd2+濃度為2、4、6、8、10μg?mL-1，Cry1Ac蛋白濃度為0.2、0.8、1、2、4μg?mL-1，復(fù)合體系的濃度配比為1∶1，濃度為0.2、1、2、4μg?mL-1，培養(yǎng)24 h。不添加Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白的對(duì)照組加入1 mL蒸餾水。
1.2.2平板計(jì)數(shù)
在固體LB培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的Zn2+、Cd2+及Zn2+-Cry1Ac、Cd2+-Cry1Ac復(fù)合體系（Zn2+：4、8、12、16、20μg?mL-1；Cd2+：2、4、6、8、10μg?mL-1；復(fù)合體系：2、4μg?mL-1）溶液，將對(duì)數(shù)期的E.coli和B.subti?lis菌液稀釋6倍，分別取100μL均勻涂布于各平板上，在37℃恒溫培養(yǎng)12 h后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。以不添加Zn2+、Cd2+和Cry1Ac蛋白培養(yǎng)的細(xì)菌菌落數(shù)作為對(duì)照活菌數(shù)（CK），用立體計(jì)數(shù)儀對(duì)活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，記錄各平板上的菌落數(shù)，選取菌落數(shù)在30~300個(gè)之間的平板用于計(jì)算，求出同一處理組平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)。由公式（1）計(jì)算存活率：1.2.3細(xì)菌活性氧測(cè)定
按照1.2.2的步驟收集處理后的E.coli和B.subtilis菌液至50 mL離心管，6 000 r?min-1離心10 min；用pH為7.02的PBS緩沖液洗滌，6 000 r?min-1離心5 min，渦旋去除殘留；取10μL的活性氧（ROS）熒光探針（濃度為10 mol?L-1的DCFH-DA）工作液染色30 min，避光37℃孵育30 min，每隔10 min輕輕搖動(dòng)；孵育結(jié)束用磷酸鹽緩沖液充分洗滌；用酶標(biāo)儀在發(fā)射波長(zhǎng)530 nm處檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度。
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