適用于低鹽發(fā)酵香腸葡萄球菌與乳酸菌生長特性及產(chǎn)酸能力測定及篩選（二）
1.3方法
1.3.1菌株分離與純化
無菌操作下稱取10 g絞碎的樣品，轉(zhuǎn)移至100 mL無菌生理鹽水中，振蕩（200 r/m，30 min）混勻；靜置數(shù)分鐘，再取1 mL加入到9 mL無菌生理鹽水中，即成10-2稀釋度，根據(jù)需要再依次稀釋；選取合適稀釋度的樣品溶液，倒入相應(yīng)的固體培養(yǎng)基中，混勻后37℃靜置培養(yǎng)24～48 h；挑取單菌落反復(fù)劃線，直至獲得純的菌株。其中，乳酸菌的分離采用含有3%CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基，挑取具有溶鈣圈的菌株；葡萄球菌的分離采用MSA固體培養(yǎng)基。
1.3.2菌株的初步篩選
對純化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、菌體形態(tài)觀察，選擇革蘭氏陽性菌種保存。對所分離的革蘭氏陽性菌分別進(jìn)行如下篩選：
接觸酶實(shí)驗(yàn)：將37℃培養(yǎng)過夜后的菌液用接種環(huán)涂抹于已滴有5%H2O2的玻片上，立即觀察結(jié)果，3 min內(nèi)出現(xiàn)氣泡者為陽性反應(yīng)，反之為陰性。
耐硝性實(shí)驗(yàn)：以1%的接種量將菌種分別接種于不同亞硝酸鈉添加量（0、50、100、150 mg/kg）的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h，于600 nm波長處測定吸光度。
產(chǎn)酸能力測定：以1%接種量將菌株接種于液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24、48 h后測定發(fā)酵液的pH值。
對于所分離的陽性球菌菌株，分別進(jìn)行如下額外指標(biāo)的篩選：
耐酸性實(shí)驗(yàn)：以1%的接種量將菌種分別接種于NB液體培養(yǎng)基（pH值調(diào)至5.0）中，37℃培養(yǎng)48 h，于600 nm波長處測定吸光度。
溶血實(shí)驗(yàn)：用接種針取37℃培養(yǎng)過夜后的菌液，在血平板上劃線，37℃培養(yǎng)24、48、72 h后觀察結(jié)果，有溶血圈出現(xiàn)的菌株為陽性，以金黃色葡萄球菌作為陽性對照。
硝酸鹽還原酶活力測定：檢查37℃培養(yǎng)過夜后菌液的硝酸鹽還原情況，在白色搪瓷比色盤中加入1滴菌液，然后加入硝酸還原試劑A、B液各1滴，觀察菌落周圍出現(xiàn)的紅圈大小和清晰度，顯色反應(yīng)后，挑出紅圈直徑＞1.2 cm的菌株。
1.3.3菌株的復(fù)篩
對初步篩選所得到的葡萄球菌及乳酸菌菌株進(jìn)行進(jìn)一步的篩選：
蛋白酶活性檢測：將37℃培養(yǎng)過夜后的新鮮菌液分別點(diǎn)接種在脫脂牛乳平板培養(yǎng)基（SM）上，培養(yǎng)5 d。觀察菌落周圍透明圈的大小。
氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)：將37℃培養(yǎng)過夜后的菌液傾注到氨基酸脫羧酶檢測培養(yǎng)基（分別含有0.5%酪氨酸、0.25%組氨酸、賴氨酸及精氨酸，以不添加氨基酸作為空白對照）中，37℃培養(yǎng)，變色則為陽性。
精氨酸雙水解酶實(shí)驗(yàn)：將37℃培養(yǎng)過夜后的菌液傾注到精氨酸雙水解酶檢測培養(yǎng)基（含有1%L-精氨酸鹽）中，37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化為紅色者為陽性。
對于初步篩選得到的葡萄球菌菌株，分別進(jìn)行如下額外指標(biāo)的篩選：
脂肪酶活性檢測：將37℃培養(yǎng)過夜后的新鮮菌液分別點(diǎn)接種在三丁酸甘油酯培養(yǎng)基（TB）上，培養(yǎng)5 d，觀察菌落周圍透明圈。
乙偶姻產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)：接種葡萄球菌菌株于乙偶姻檢測培養(yǎng)基，取培養(yǎng)液和40%NaOH等量混合。加少許肌酸，如果培養(yǎng)液10 min出現(xiàn)紅色即為陽性反應(yīng)。
對于所分離的乳酸菌菌株，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)作為額外的篩選指標(biāo)：將乳酸菌菌株培養(yǎng)至約為108CFU/mL，點(diǎn)接種于已含有106CFU/mL的敏感指示菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌以及蠟樣芽孢桿菌）的固體平板上，37℃培養(yǎng)12 h，觀察菌落周圍是否存在抑菌圈。
1.3.4菌株的分類學(xué)鑒定
形態(tài)學(xué)觀察：將菌株平板劃線于固體培養(yǎng)基上，觀察菌落形態(tài)，挑取對數(shù)生長期的菌體進(jìn)行革蘭氏染色后顯微鏡下觀察菌體細(xì)胞形態(tài)。
生理生化實(shí)驗(yàn)：參照《乳酸細(xì)菌現(xiàn)代研究實(shí)驗(yàn)技術(shù)》及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對篩選菌株的生理生化特性進(jìn)行檢測，包括精氨酸雙水解酶實(shí)驗(yàn)、糖醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等。
16S rDNA分子生物學(xué)鑒定：細(xì)菌基因組DNA按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行提取。以提取基因組作為PCR擴(kuò)增的模板，利用通用引物L(fēng)pw57（5’-AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’）及Lpw205（5’-CTT GTT ACG ACT TCA CCC-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25μL）為：10×Buffer 2.5μL、模板DNA 1μL、引物各2.5μL、dNTP 2μL、Taq DNA聚合酶0.25μL、dd H2O 14.25μL，混勻5 min。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃1 min、43℃30 s、72℃90 s，進(jìn)行30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分析后由北京諾賽基因組研究中心測序。
系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：所得菌株序列根據(jù)NCBI網(wǎng)站的BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對鑒定，根據(jù)鑒定結(jié)果及相似性較高的幾株菌的16S rRNA，利用MEGA軟件進(jìn)行菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。
1.3.5菌株的生長特性及產(chǎn)酸能力測定
將菌株接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)（葡萄球菌接種在NB液體培養(yǎng)基中200 r/min振蕩培養(yǎng)，乳酸菌接種在MRS液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)），以液體培養(yǎng)基為空白對照，每2 h用紫外分光光度計(jì)于600 nm波長處測定吸光度，用酸度計(jì)測定菌液的pH值。
1.3.6菌株間拮抗性測試
用含乳酸菌的接種環(huán)，在低鹽模擬肉湯固體培養(yǎng)基（NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%）上劃一直線接菌。37℃條件下培養(yǎng)48 h，待形成菌落后，沿菌落邊緣（不接觸）用接種環(huán)從垂直方向接種葡萄球菌；37℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察乳酸菌對于葡萄球菌的抑制效果。
1.4數(shù)據(jù)處理
所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次，使用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析，使用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及作圖。
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