紅三葉草葉際微生物群落為何對炭疽病具有抵抗力
2025年4月14日，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)殷秀杰教授團(tuán)隊(duì)在《Microbiological Research》期刊上共同發(fā)表了題為“Role of the beneficial phyllosphere microbiome in the defense against red clover anthracnose caused by Colletotrichum americae-borealis”的研究論文。研究通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)及多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，首次確認(rèn)了Colletotrichum americae-borealis（Cab）是引起中國紅三葉草炭疽病的主要病原體，并探討了有益微生物在增強(qiáng)植物抗病性方面的作用。研究表明，特定細(xì)菌如Bacillus J2能夠顯著抑制病原體生長并增強(qiáng)紅三葉草的防御反應(yīng)。
紅三葉草（Trifolium pratense）是一種重要的牧草資源，在東北地區(qū)面臨嚴(yán)重的炭疽病威脅。炭疽病由多種病原菌引起，導(dǎo)致葉片枯萎和植株死亡，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和質(zhì)量。盡管已知幾種Colletotrichum屬真菌是全球范圍內(nèi)紅三葉草炭疽病的主要致病因子，但在中國的具體病原尚未明確。此外，關(guān)于紅三葉草葉際微生物群落如何影響其對炭疽病的抵抗力知之甚少。因此，了解這些微生物的作用對于開發(fā)有效的生物防治策略至關(guān)重要。
1.病原鑒定：通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)及多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，確定Colletotrichum americae-borealis為紅三葉草炭疽病的主要病原體。
2.微生物組變化：高抗性和易感材料在感染后表現(xiàn)出顯著不同的微生物α-和β多樣性，特別是高抗性材料中出現(xiàn)了新的微生物類群和復(fù)雜的微生物網(wǎng)絡(luò)。
3.關(guān)鍵細(xì)菌作用：Bacillus J2顯著抑制Cab生長，并通過調(diào)控植物激素信號通路增強(qiáng)了宿主的抗病能力。
1.紅三葉炭疽病病原菌鑒定
為了鑒定紅三葉炭疽病病原菌，作者首先從病葉中分離118株菌株，選取18株代表分離物（HTC1-HTC18）在PDA上培養(yǎng)14天進(jìn)行通過顯微鏡和培養(yǎng)特征觀察，發(fā)現(xiàn)其菌落形態(tài)、分生孢子及剛毛特征均與C.americae-borealis的描述一致。為驗(yàn)證其致病性，用分離菌株（HTC1-HTC18）接種健康紅三葉葉片，結(jié)果接種植株表現(xiàn)出與田間病株完全一致的癥狀，從而確認(rèn)了這些菌株的致病性（圖1）。為進(jìn)一步準(zhǔn)確鑒定病原菌種類，作者選取了3株代表菌株（HTC1-HTC3）進(jìn)行多基因（ITS、GAPDH、HIS、RPB2）測序和親緣關(guān)系比對，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，最終確定引起紅三葉炭疽病的病原菌為C.americae-borealis。
圖1：由Colletotrichum americae-borealis引起的紅三葉草炭疽病癥狀及C.americae-borealis的形態(tài)特征
2.16S rRNA基因測序
樣品采集與處理：選擇高抗性材料XJ和易感材料SC進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)，噴施Cab菌懸液為實(shí)驗(yàn)組，無菌水作為對照（圖2）。收集感染和健康葉片樣本，提取表面微生物DNA。接種7天后，分別收集表現(xiàn)出明顯感染癥狀的葉片和無癥狀的健康葉片樣本。收集的葉片置于含有200 mL 0.01 M磷酸鹽緩沖液（PBS）的滅菌容器中，混合物在26°C下以200 rpm的速度搖晃2小時(shí)，以確保微生物充分脫離葉片表面并懸浮于PBS中。隨后，洗滌液通過0.22μm的無菌纖維素膜過濾，以捕獲溶液中所有的微生物用于DNA提取（圖2）。
圖2：紅三葉草對炭疽病的抗性評估
測序與數(shù)據(jù)分析：使用NovaSeq 6000平臺進(jìn)行測序，獲得高質(zhì)量的16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)。通過QIIME 2軟件分析，去除低質(zhì)量序列并進(jìn)行ASV聚類，計(jì)算Shannon多樣性指數(shù)（圖3a）。PCoA分析顯示不同處理組間的微生物群落組成差異顯著（圖3b）。
圖3：葉際微生物群落的結(jié)構(gòu)與多樣性
3.共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析
基于微生物群落的相關(guān)性，構(gòu)建了XJ和SC材料的葉際微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)（圖4）。結(jié)果顯示，無論是否接種Cab，XJ材料的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)和邊數(shù)均高于SC材料，表明其微生物群落更為復(fù)雜且穩(wěn)定。
圖4：XJ和SC材料葉際微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)
4.細(xì)菌分離與鑒定
從紅三葉草葉片表面分離出118株細(xì)菌，并進(jìn)一步通過雙培養(yǎng)試驗(yàn)評估其對病原菌Cab的拮抗作用。其中，Bacillus J2、Pantoea J28和Pseudomonas J83表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗活性（圖5），平均抑制率分別為69.71%、62.61%和60.68%。此外，Bacillus sp.(J2)、Pantoea aggregata(J28)和Pseudomonas oryzihabitans(J83)的16S rRNA基因序列與ASV_104、ASV_559和ASV_696的序列一致性達(dá)到99%。這些結(jié)果表明，J2、J28和J83是在接種Cab后XJ中富集的細(xì)菌菌株（圖5）。
圖5：葉際微生物分離與鑒定及Cab抑制
5.基因表達(dá)分析
為了驗(yàn)證J2對植物防御機(jī)制的影響，研究進(jìn)行了溫室實(shí)驗(yàn)，預(yù)處理易感材料SC后再接種Cab。分別在接種后的第5、7、10和14天監(jiān)測病情指數(shù)，并收集葉片樣本用于RNA提取。qRT-PCR結(jié)果顯示，J2顯著上調(diào)了多個(gè)關(guān)鍵防御相關(guān)基因（如RPP13、PTI1、NPR1、PR1等）的表達(dá)水平（圖6），說明J2通過激活植物免疫系統(tǒng)增強(qiáng)了抗病性。
圖6：J2促進(jìn)植物生長并增強(qiáng)植物防御基因表達(dá)的效果
本研究首次報(bào)道了Colletotrichum americae-borealis是中國紅三葉草炭疽病的主要病原體，并揭示了有益微生物尤其是Bacillus J2在增強(qiáng)植物抗病性方面的潛力。通過16S rRNA基因測序、共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析和基因表達(dá)分析等組學(xué)手段，詳細(xì)解析了紅三葉草葉際微生物群落在應(yīng)對炭疽病時(shí)的變化規(guī)律及其對植物健康的積極影響。這些發(fā)現(xiàn)不僅加深了我們對植物-微生物互作機(jī)制的理解，也為未來開發(fā)基于微生物的植物保護(hù)策略提供了理論依據(jù)。