微生物生長曲線系統評估黑曲霉孢子在不同銅離子濃度下的生長情況
研究背景：真菌污染在各種工業和環境環境中仍然是一個持續的挑戰。表明真菌感染和霉菌傳播帶來的威脅越來越大，無論是在數量還是嚴重程度方面。為了減輕這種風險，必須制定和實施有效的預防策略，旨在抑制真菌孢子的傳播和生長，特別是在臨床環境和狹窄建筑空間等關鍵環境中。近年來由于絲狀真菌對不斷變化的環境條件的適應性，越來越被認為是人類健康和農業的主要問題。最近的研究進一步表明，尤其是全球變暖正在改變絲狀真菌和酵母的耐熱性。本研究聚焦于黑曲霉孢子對銅表面的應激反應及其對抗霉表面功能化的影響。真菌污染在醫療、農業和工業領域是一個持續存在的挑戰，因為真菌具有很強的環境適應性和對殺菌劑的抗性。
為了應對這一問題，研究者們利用超短脈沖激光誘導的周期性表面結構（USP-DLIP）技術，對銅、黃銅和鋼表面進行功能化處理，設計了3微米和9微米的拓撲結構，以評估其抗真菌效果。研究方法包括銅離子釋放量的測量、掃描電子顯微鏡（SEM）分析、濕接觸殺滅實驗以及代謝活性測試。結果顯示，9微米周期的銅表面結構能夠實現99%的孢子活性降低，表明銅離子釋放增加是增強抗真菌效果的關鍵因素。SEM分析確認了孢子在銅表面的顯著損傷，而鋼表面的孢子則相對完整。代謝活性測試表明，接觸過銅、黃銅和鋼表面的孢子顯示出更快的代謝活性恢復。此外9微米結構的銅表面在抗真菌效果上優于3微米結構，而黃銅和鋼表面的抗真菌效果不顯著。
研究結論指出，USP-DLIP技術處理的銅表面在抗真菌方面表現出顯著效果，特別是9微米結構的銅表面能夠顯著降低黑曲霉孢子的活性。增加表面結構的復雜性可以提高銅離子的釋放量，從而增強抗真菌效果。盡管黃銅和鋼表面也經過了USP-DLIP處理，但它們的抗真菌效果不明顯，這可能與銅離子的釋放量和真菌對金屬離子的耐受性有關。研究還強調了銅表面在實際應用中的長期穩定性和耐腐蝕性需要進一步研究。
丹麥Biosense微生物生長曲線監測系統的應用
oCelloScope是一種自動化微生物成像設備，用于評估黑曲霉（Aspergillus niger）孢子在不同銅離子濃度下的生長情況。oCelloScope通過定期拍攝孢子的生長情況，生成高分辨率的顯微圖像。這些圖像用于觀察孢子的萌發、菌絲生長以及形態變化。通過設備內置的SESA（Segmentation and Extraction of Surface Areas）算法能夠自動分析孢子的生長曲線。通過計算孢子在不同時間點的生長面積。oCelloScope能夠在長達30小時的實驗期間持續監測孢子的生長情況，每隔30分鐘拍攝一次圖像。這種長時間的監測能力使得研究者能夠全面了解孢子在不同銅離子濃度下的生長動態。將黑曲霉孢子暴露于不同濃度的CuSO?溶液中，然后將這些孢子轉移到含有最小培養基（MM）的96孔板中。使用oCelloScope拍攝孢子在30°C下培養30小時的生長情況。通過分析孢子的萌發和菌絲生長，發現隨著銅離子濃度的增加，孢子的生長受到顯著抑制。oCelloScope的自動化成像和分析功能大大提高了實驗效率，減少了人為操作的誤差。
實驗結論
通過實驗評估了超短脈沖激光誘導的周期性表面結構（USP-DLIP）對銅、黃銅和鋼表面的抗真菌功能化效果，特別是針對黑曲霉（Aspergillus niger）孢子的應激反應。9微米周期的銅表面結構能夠實現99%的孢子活性降低，表明銅離子釋放增加是增強抗真菌效果的關鍵因素。SEM分析顯示，銅表面的孢子出現顯著的細胞壁破裂和形態塌陷，而鋼表面的孢子則相對完整。增加表面結構的復雜性（如9微米結構）可以提高銅離子的釋放量，從而增強抗真菌效果。3微米和9微米結構的銅表面在抗真菌效果上存在顯著差異，9微米結構表現更優。銅表面在實驗室條件下表現出良好的抗真菌效果，但在實際應用中，其長期穩定性和耐腐蝕性需要進一步研究。真菌（如黑曲霉）可能通過產生草酸等代謝產物加速銅表面的腐蝕，這可能影響銅表面的長期抗真菌效果。
圖1、銅表面對微生物物種抗菌作用的簡化方案，這里是真菌細胞的示例。A，B）銅離子從銅表面溶解并進入微生物（真菌細胞）壁和膜。通過與嵌入膜中的銅轉運蛋白的直接相互作用或通過被動機制（如跨膜的電化學梯度）進行主動運輸，導致膜電位和細胞質內容物的損失。銅離子在細胞內的積累必須達到一定的閾值才會變得有毒，這個閾值因生物體而異。C）不同的銅種類通過Fenton樣反應誘導活性氧（ROS）的產生，基因組和質粒DNA降解，最終導致細胞死亡。
圖2、在30°C（終點）下孵育30小時后，所有測試的CuSO4濃度（10×10、20×10、30×10、40×10、50×10m）以及兩種菌株的未處理對照。比例尺對應于50μm
圖3、以SESAfun規范[a.u].對應于A）野生型菌株和B）色素沉著突變菌株隨時間變化的真菌質量。陽性（未處理的）真菌孢子顯示為綠色。
圖4、A）A.niger野生型N402孢子和B）A.niger色素沉著突變菌株（MA 93.1）在與相應的功能化表面接觸30、60和120分鐘后的存活數據。存活分數（N/N0）是相對于未暴露的孢子計算的（與金屬表面沒有任何接觸的初始孢子濃度）。
圖5、與結構化（3μm）銅、黃銅和鋼以及未經處理的孢子接觸后，孢子生長和發芽過程中代謝活性的發育，沒有任何金屬表面接觸。代謝活性測量為A）A.niger野生型N402孢子和B）A.niger色素沉著突變菌株（MA 93.1）與3μm USP-DLIP功能化表面接觸120分鐘后刃天青（%）的相應減少。將陽性對照的代謝速率與處理過的孢子進行比較，觀察到以下顯著性：A）鋼3μm（p=0.010）、銅3μm（p=0.0007）和黃銅3μm（p=0.0006）。數據顯示為平均值±標準誤差（n=3）。值得注意的是，在野生型孢子（p=0.03）的12小時時觀察到鋼和銅表面之間的特異性顯著差異，盡管由于隨著時間的推移重疊的代謝趨勢，這種差異很難可視化。B）鋼3μm（p=0.006），銅3μm（p=0.010）和黃銅3μm（p=0.004）。
總結
USP-DLIP結構化銅表面顯著增強了抗真菌功效，特別是針對野生型菌株，其中9μm結構導致真菌孢子活力顯著降低。這凸顯了表面結構作為開發先進抗菌材料的強大策略的潛力。研究結果表明，結構化地形會影響真菌活力，即使在非抗菌材料上也是如此，如在鋼表面上觀察到的輕微抗真菌效果所示。相比之下，黃銅表面的真菌活力沒有表現出類似的降低，這可能是由于有毒銅離子的生物利用度有限和鋅的同步釋放，真菌可能會將其用作微量營養素，而不是將其作為壓力源。
oCelloScope是一種自動化微生物成像設備，用于評估黑曲霉（Aspergillus niger）孢子在不同銅離子濃度下的生長情況，為研究黑曲霉孢子對銅離子的耐受性提供了有力的支持。oCelloScope通過定期拍攝孢子的生長情況，生成高分辨率的顯微圖像。這些圖像用于觀察孢子的萌發、菌絲生長以及形態變化。oCelloScope能夠在長達30小時的實驗期間持續監測孢子的生長情況，每隔30分鐘拍攝一次圖像。這種長時間的監測能力使得研究者能夠全面了解孢子在不同銅離子濃度下的生長動態。
此外鋅與銅的吸收競爭及其在草酸鹽復合物形成中的作用可能會進一步減輕銅的毒性，從而有助于在黃銅表面觀察到的抗真菌作用減弱。這些結果強調了材料成分和表面結構在優化抗真菌表面設計中的重要性。精確的表面修飾可以顯著增強抗真菌活性，但在真菌恢復力和對銅基抗菌表面的適應性方面仍然存在很大的知識差距。此外USP-DLIP結構在實際應用中的長期耐久性需要進一步研究，尤其是在材料老化和暴露于實際污染物（如汗液、唾液和有機殘留物）的情況下。本研究為開發新型銅基抗真菌材料提供了重要見解，并評估了銅和銅合金表面的抗真菌潛力。這些發現對于設計和優化抗真菌表面具有重要意義，尤其是在醫療、工業和空間探索等領域。
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