國內(nèi)新發(fā)病原牛皰疹病毒4型(BoHV-4)qPCR鑒定、分離及一步生長曲線測(cè)定（一）
[目的]本文旨在對(duì)一種與奶牛繁殖障礙疾病有關(guān)的國內(nèi)新發(fā)病原牛皰疹病毒4型(BoHV-4)進(jìn)行檢測(cè)、分離與鑒定。[方法]采集我國東北地區(qū)某養(yǎng)牛場(chǎng)疑似發(fā)生BoHV-4感染牛的生殖道拭子，將陽性樣本接種HeLa細(xì)胞分離病毒，通過特異性qPCR、間接免疫熒光(IFA)及電鏡觀察等方法對(duì)分離病毒進(jìn)行鑒定，并測(cè)定病毒一步生長曲線。用PCR擴(kuò)增病毒gB和TK基因并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。[結(jié)果]陽性樣本接種細(xì)胞后盲傳3代，能夠產(chǎn)生圓縮、聚集等皰疹病毒典型細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，從IFA結(jié)果觀察到感染病毒的細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的特異性綠色熒光，電鏡觀察感染細(xì)胞可見直徑100～150 nm的病毒粒子，衣殼和囊膜結(jié)構(gòu)清晰，將該毒株命名為TL01。其生長曲線顯示在感染后36 h達(dá)到峰值(106.3TCID50·mL-1)。PCR擴(kuò)增病毒gB和TK基因并對(duì)其序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)TL01的gB基因與參考株DN599在同一分支，屬于基因2型;TL01的TK基因與參考株Movar33/63同屬于基因1型。[結(jié)論]本研究成功分離出1株BoHV-4毒株，為深入研究BoHV-4的生物學(xué)特性和流行病學(xué)提供參考。
引言
牛皰疹病毒4型(bovine herpesvirus 4，BoHV-4)屬于皰疹病毒科丙型皰疹病毒亞科。常與牛的生殖系統(tǒng)疾病相關(guān)，主要致病癥狀包括流產(chǎn)、生殖道皰疹、產(chǎn)后子宮拉傷及配種障礙等。此外，BoHV-4也會(huì)與其他病原體混合感染引起產(chǎn)后疾病或慢性子宮炎，造成生產(chǎn)性能下降。
國外最早在20世紀(jì)60年代報(bào)道該病毒。Bartha等首次從匈牙利患有呼吸系統(tǒng)疾病和結(jié)膜炎的犢牛身上分離出該毒株，被命名Movar33/63。Mohanty等在美國新澤西州從有呼吸系統(tǒng)臨床癥狀的牛鼻拭中分離出1株類似的病毒，命名為DN599。隨后在阿根廷、西班牙、埃及等國家報(bào)道臨床分離株。該病毒能夠從無臨床癥狀的動(dòng)物身上分離，也能夠從具有各種生殖系統(tǒng)疾病癥狀或者患有潰瘍性乳腺炎和皮膚病變的牛身上分離。但在我國直到2021年才首次報(bào)道BoHV-4的存在，目前對(duì)該病毒在我國流行情況及毒株特性的研究仍十分缺乏。BoHV-4不僅可在常見的MDBK細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，而且可以在人類細(xì)胞系中復(fù)制，例如人胚胎肺細(xì)胞和HeLa細(xì)胞。
BoHV-4病毒顆粒較大(直徑150～200 nm)，是有囊膜的二十面體粒子，基因組大小約144 kb。根據(jù)限制性內(nèi)切酶圖譜，在初期將BoHV-4分為2種基因型:Movar33/63-Like型和DN599-Like型。2012年，研究人員對(duì)從阿根廷流產(chǎn)奶牛的宮頸陰道黏液中分離出的BoHV-4毒株進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，MGA1075株和07435株具有相似的核酸內(nèi)切酶圖譜，但與Movar33/63-Like型和DN599-Like型均具有較大差異，因此新定義了基因3型，揭示了其復(fù)雜的遺傳背景。研究發(fā)現(xiàn)，基于該病毒的糖蛋白(glycoprotein B，gB)和胸苷激酶(thymidin kinase，TK)基因的序列差異性，繪制出毒株的分子遺傳進(jìn)化樹，表明gB和TK基因均可用于該病毒的基因分型，基于TK基因的進(jìn)化樹體系可以提供更加準(zhǔn)確的基因分型。
本研究通過對(duì)東北地區(qū)某牧場(chǎng)采集到的樣品進(jìn)行檢測(cè)與病毒分離，鑒定后以gB和TK基因?yàn)榘袠?biāo)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以獲得該分離株的分子遺傳進(jìn)化信息，為該病毒的流行病學(xué)分析提供資料以及為國內(nèi)BoHV-4的診治和預(yù)防提供參考。
1材料與方法
1.1材料
生殖道拭子采自東北地區(qū)某牧場(chǎng)出現(xiàn)生殖道皰疹和繁殖障礙的病牛;HeLa細(xì)胞、BoHV-4 gB小鼠多克隆抗體由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織豬鏈球菌病參考實(shí)驗(yàn)室保存。qPCR反應(yīng)酶購自青島立見生物科技有限公司。PCR擴(kuò)增高保真酶、DNA/RNA磁珠法提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM購自武漢普諾賽生物科技有限公司。
1.2引物設(shè)計(jì)及合成
使用本實(shí)驗(yàn)室前期設(shè)計(jì)的BoHV-4、BoHV-1、BVDV(牛病毒性腹瀉病毒)的qPCR引物;同時(shí)根據(jù)GenBank中的BoHV-4全基因組序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增gB和TK基因的特異性PCR引物。引物信息見表1，引物均由生工生物科技有限公司合成。
表1本試驗(yàn)所用的引物信息
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