雙歧桿菌分離鑒定、耐受性試驗、益生特性試驗及安全性評價（一）
雙歧桿菌是一種無芽胞，不運動、不產(chǎn)氣的菌株，屬于革蘭陽性菌，且對厭氧環(huán)境要求較嚴格，通常呈現(xiàn)為不規(guī)則的V型或Y型桿狀。1899年，首次從母乳喂養(yǎng)嬰兒糞便中獲得第一株雙歧桿菌。目前研究報道已有100余種雙歧桿菌，其中有5種雙歧桿菌如動物雙歧桿菌乳亞種等可作為益生菌于功能性食品中應(yīng)用。眾多研究表明雙歧桿菌是人體腸道菌群的重要組成，形成了與人體協(xié)同進化的共生關(guān)系，在維持宿主腸道環(huán)境穩(wěn)定、抑制腸道致病菌生長、改善人體乳糖不耐癥、提高免疫調(diào)節(jié)能力、降低膽固醇、緩解便秘、抗炎癥等方面發(fā)揮重要作用。
雙歧桿菌作為厭氧菌，其營養(yǎng)環(huán)境和生長條件較為苛刻，傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法對于雙歧桿菌菌株的分離仍具有一定的難度，目前，提高雙歧桿菌分離效率的方法主要為添加適當還原劑、使用特定種類抗生素或促雙歧桿菌生長因子以促進雙歧桿菌生長，或加入顯色劑以明顯區(qū)分雙歧桿菌。因此，選擇雙歧桿菌分離的特異性培養(yǎng)基可有效提高純培養(yǎng)方法對雙歧桿菌的分離效率，獲得更多的雙歧桿菌菌株。
人體來源的雙歧桿菌可能具有較強的胃腸道應(yīng)激存活率和穩(wěn)定的基因組，因此其有可能具備潛在的益生特性，這使得它們在篩選益生菌時更具優(yōu)勢。路江浩等對嬰兒來源雙歧桿菌進行篩選最終得到1株具有優(yōu)良益生特性的動物雙歧桿菌乳亞種BAL531。王明芳等對新疆地區(qū)哈薩克族兒童糞便樣本進行雙歧桿菌的分離并篩選得到2株特性優(yōu)良的菌株，為開發(fā)適宜特定區(qū)域特定人群的益生菌株產(chǎn)品提供數(shù)據(jù)支持。益生雙歧桿菌在醫(yī)療和生物制劑領(lǐng)域也得到了廣泛應(yīng)用。鐘明月等通過對動物雙歧桿菌乳亞種V9進行研究發(fā)現(xiàn)其對由高脂飲食誘導的非酒精性脂肪性肝病大鼠有緩解作用。楊晨等的研究表明長雙歧桿菌長亞種BBMN68可緩解小鼠牛乳β?乳球蛋白過敏反應(yīng)。綜上所述，收集和保藏優(yōu)質(zhì)雙歧桿菌資源，深入探討雙歧桿菌益生作用，對我國自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良益生雙歧桿菌開發(fā)應(yīng)用有重要意義。
因此，本研究招募48名健康志愿者并采集其糞便樣本，基于傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)采用不同種類培養(yǎng)基分離雙歧桿菌菌株，通過16S rRNA基因測序技術(shù)對所分離菌株進行鑒定。經(jīng)耐酸性、耐膽鹽及人工胃腸液耐受性試驗篩選潛在益生特性的雙歧桿菌菌株，分析其自聚集率、疏水率、抑菌能力等特性，并驗證其安全性，為益生雙歧桿菌的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
1.材料與方法
1.1材料
1.1.1志愿者糞便樣本采集
本試驗招募48名健康志愿者，詳細說明試驗?zāi)康暮头椒ǖ那疤嵯路职l(fā)糞便無菌采樣器，志愿者自然排便后按照采樣器說明書采集糞便樣本3～5 g，立刻放入冰盒中低溫保存，并盡快送至實驗室或通知實驗室人員帶回以進行菌株分離。本試驗已獲得倫理委員會審查（批號：2020014）。
1.1.2主要培養(yǎng)基
用于糞便樣本分離雙歧桿菌的培養(yǎng)基見表1。
表1用于分離雙歧桿菌的培養(yǎng)基
1.1.3抑菌試驗用實驗菌株
腸沙門菌（Salmonella enterica CICC 10982）、大腸埃希菌（Escherichia coli CICC 23657）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 12600）和福氏志賀菌（Shigella flexneri CICC 21678）均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室保藏。
1.2方法
1.2.1雙歧桿菌菌株的分離純化和保藏
將0.5 g糞便樣本按10倍梯度與0.85%生理鹽水充分混勻進行稀釋，于厭氧工作站中保持過程的嚴格無氧。選擇適宜梯度吸取0.2 mL菌液涂布于不同培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)48～72 h，菌落形成后記錄菌落形態(tài)，挑取單菌落進行分離純化，并將純培養(yǎng)物接種至無菌液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h，進行革蘭染色檢測，對革蘭染色陽性無芽胞的、桿狀菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)至第3代后3 179×g離心5 min收集菌體細胞，1/2菌體細胞分裝至2 mL Ep管中用于后續(xù)提取DNA，剩余菌體加入脫脂乳保護液分裝至保存管中，于?80℃冷凍保藏。
1.2.2菌株的鑒定
使用TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒對上述菌體細胞進行DNA提取，對檢測合格的DNA采用聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）對DNA片段進行擴增。使用16S rRNA基因的通用引物對其進行擴增和序列測定。細菌通用引物：正向引物為27F（5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），反向引物為1492R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）。PCR產(chǎn)物使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)進行檢測，產(chǎn)物在1 500 bp處有明亮清晰的條帶且無拖尾現(xiàn)象，則表明PCR產(chǎn)物可以滿足測序要求。將菌株P(guān)CR擴增產(chǎn)物以保持低溫狀態(tài)寄送至南京派森諾基因科技有限公司進行測序，序列結(jié)果進行拼接后與NCBI已公布序列進行同源性對比，依據(jù)相似度和覆蓋率進行判定，初步確定菌株分類學地位。應(yīng)用MAGA 7.0軟件與模式菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其發(fā)育關(guān)系，綜合NCBI數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系對菌株進行鑒定。
1.3雙歧桿菌菌株益生特性篩選
1.3.1酸耐受能力試驗
將雙歧桿菌按4%（v/v）的接種量接種于5 mL MRS培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)物再次同法進行傳代培養(yǎng)2次，將第3代菌液3 179×g離心5 min后收集菌體細胞，無菌PBS洗滌2次后重懸制成供試菌懸液。將供試菌懸液按照2%（v/v）的接種量接種于pH 3.0的MRS培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，動物雙歧桿菌乳亞種V9作為對照菌株，通過實時動態(tài)成像，Biosense自動生長曲線分析系統(tǒng)可以動態(tài)、實時地觀察、拍照、攝像菌株的動態(tài)生長和測量生長曲線，選取生長12 h后菌體密度增長較大的菌株進行后續(xù)試驗。
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