膿腫分枝桿菌胞內(nèi)菌落計數(shù)、對RAW264.7細胞血紅素氧化酶1調(diào)控自噬影響（一）
摘要
目的：探討血紅素氧化酶1（HO-1）調(diào)控自噬對膿腫分枝桿菌（M.abs）胞內(nèi)生長的影響。
方法：M.abs標(biāo)準(zhǔn)株ATCC19977按照指定的感染復(fù)數(shù)（MOI）刺激小鼠RAW264.7巨噬細胞特定時間，Western blot檢測HO-1蛋白表達水平和自噬相關(guān)蛋白Atg5、LC3Ⅱ、p62蛋白表達水平。采用HO-1特異性誘導(dǎo)劑CoPP和酶活性抑制劑SnPP預(yù)處理巨噬細胞12 h，加入M.abs共孵育2 h，阿米卡星去除胞外菌后繼續(xù)培養(yǎng)至指定時間，CCK-8法檢測細胞活性；Western blot、LysoTracker Red檢測HO-1蛋白與自噬相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)關(guān)系；菌落計數(shù)、ELISA分別檢測細胞內(nèi)細菌存活情況和TNF-α分泌水平。
結(jié)果：與對照組相比，M.abs能誘導(dǎo)HO-1和Atg5、LC3Ⅱ、p62蛋白表達水平升高；HO-1過表達和抑制能有效調(diào)控M.abs誘導(dǎo)的Atg5、LC3Ⅱ和p62表達。LysoTracker Red、菌落計數(shù)和ELISA結(jié)果顯示，SnPP促進細胞內(nèi)溶酶體增加，顯著抑制M.abs胞內(nèi)繁殖并減少TNF-α分泌。
結(jié)論：抑制HO-1能增強M.abs誘導(dǎo)的自噬流，減少M.abs胞內(nèi)生長，為研發(fā)以抑制HO-1為靶點的靶向藥物提供科學(xué)依據(jù)。
非結(jié)核分枝桿菌是除了結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌外的分枝桿菌的總稱，也稱為非典型分枝桿菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM）。膿腫分枝桿菌（Mycobacterium abscessus，M.abs）是臨床NTM分離株中最為常見的菌種之一。細菌對傳統(tǒng)藥物耐藥性高，需多種藥物聯(lián)合使用，治療療程長，不良反應(yīng)多，預(yù)后較差，被臨床認(rèn)為是最難治療的感染性疾病之一。目前，有文獻提出積極治療病原體和提高機體免疫調(diào)節(jié)并重的M.abs感染的治療方案。因此，研究以宿主導(dǎo)向治療（host-directed therapies，HDT）為核心的免疫治療手段可能是將來對M.abs治療的重點。自噬是機體為維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)而對受損蛋白進行分解代謝的一種固有免疫機制，可能是未來治療M.abs臨床應(yīng)用的方向之一。典型自噬主要包括吞噬泡的形成、自噬體的形成、自噬溶酶體形成和降解。研究表明，機體自噬增強對細菌感染的清除具有重要意義，如人中性粒細胞可通過增強自噬途徑殺滅胞內(nèi)類鼻疽伯克霍爾德菌。雖然機體可通過自噬清除胞內(nèi)菌，但一些胞內(nèi)菌也衍生出阻斷自噬流的策略，導(dǎo)致自噬無法完成生物學(xué)功能。KIM等發(fā)現(xiàn)M.abs臨床分離株可通過抑制自噬溶酶體融合促進其自身在胞內(nèi)存活。因此，尋找到一種關(guān)鍵蛋白能有效調(diào)節(jié)自噬，可能為M.abs感染性疾病的免疫治療提供一種新的途徑。
血紅素氧化酶1（heme oxygenase 1，HO-1）是能催化游離血紅素降解為一氧化碳、亞鐵離子和膽綠素，對細胞和組織具有保護作用的酶，其催化產(chǎn)物一氧化碳和膽綠素均證明具有抗炎作用。然而HO-1在M.abs感染性疾病中具有不同作用。ABDALLA等證實抑制HO-1能有效抑制M.abs胞內(nèi)存活，給予HO-1催化產(chǎn)物可恢復(fù)M.abs胞內(nèi)繁殖。說明HO-1對于M.abs胞內(nèi)增殖起到關(guān)鍵作用。SO和OH研究發(fā)現(xiàn)，siRNA干擾HO-1有效提高細胞LC3Ⅱ表達，Atg5 siRNA干擾癌細胞可誘導(dǎo)HO-1大量表達。說明HO-1與宿主自噬存在調(diào)節(jié)關(guān)系。但是HO-1對M.abs誘導(dǎo)自噬和溶酶體調(diào)節(jié)作用尚不清楚。基于HO-1在M.abs胞內(nèi)增殖和細胞自噬中起到重要作用，本研究探討了HO-1對M.abs誘導(dǎo)自噬的調(diào)控關(guān)系及調(diào)控結(jié)局的影響，為后續(xù)抗菌藥物的研發(fā)提供科學(xué)理論和實驗依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1細胞和菌株來源
鼠源性RAW264.7細胞購于上海細胞庫細胞寶藏中心；M.abs標(biāo)準(zhǔn)株ATCC19977粗糙型（R型）由北京結(jié)核病診療技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)盟惠贈。
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