草魚呼腸孤病毒培養(yǎng)與滴度測定、及在草魚、CIK細胞上的生長特性研究（二）
1.3.3靈敏性試驗及標準曲線繪制對重組質(zhì)粒10倍梯度稀釋后，進行熒光定量PCR擴增。參照SYBR Green熒光定量試劑盒說明書，分別取稀釋好的重組質(zhì)粒1μL為模板進行PCR擴增。反應(yīng)體系為：2×SYBR GreenⅠPCR反應(yīng)混合液10μL，10 pmol/L的上、下游引物各1μL，加ddH2O補足20μL。反應(yīng)采用三溫循環(huán)，程序為：95℃預變性10 s；95℃變性5 s，56℃退火30 s；72℃延伸15 s，40個循環(huán)，并收集熒光信號。
1.3.4特異性試驗分別取GCRV 873毒株、傳染性造血器官壞死癥病毒（IHNV）、鯉魚春季病毒血癥病毒（SVCV）核酸，以其為模板進行Realtime PCR擴增，20μL體系加模板1μL，并設(shè)立陰性對照。
1.4病毒培養(yǎng)與滴度測定
將保存于液氮中的GCRV 873毒株接種于長成致密單層的CIK細胞，28℃吸附1 h；吸棄病毒液，加入與培養(yǎng)液等量的維持液（含2%FBS的M199），28℃恒溫培養(yǎng)。每日觀察細胞形態(tài)，直至出現(xiàn)80%細胞病變，收取病毒液進行滴度測定。GCRV873的細胞培養(yǎng)液經(jīng)反復凍融后作連續(xù)10倍梯度稀釋，取10-3～10-108個稀釋度，每個稀釋度取100μL的病毒液接種于96孔板上的單層CIK細胞；每稀釋度接種8孔，28℃孵育1 h后棄去，加入維持液繼續(xù)培養(yǎng)，并設(shè)正常細胞為對照，連續(xù)觀察7 d。根據(jù)病變情況，按Karber氏法計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）。lgTCID50=L+d（s?0.5）。式中：L為病毒最低稀釋度的對數(shù)，d為組距（稀釋系數(shù)），s為各組病變數(shù)與接種數(shù)比值之和。
1.5 GCRV 873株在CIK細胞上的生長特性研究
CIK細胞培養(yǎng)于24孔細胞板，待細胞長至致密單層時，棄去培養(yǎng)液，用1×104TCID50/mL，每孔100μL的GCRV 873毒株感染細胞。感染后分別于0、2、4、8、10、12、24、36、48、72 h收取病毒細胞培養(yǎng)液，應(yīng)用建立的Real-time PCR方法檢測定各時間點的病毒RNA增殖情況，并通過對各個時間點病毒滴度的測定，檢測病毒拷貝數(shù)，同時分別顯微鏡觀察0、12、24、36、48、72 h的CIK病變情況。
1.6 GCRV 873株在草魚體內(nèi)的生長特性研究
試驗魚用MS222溶液（1 mg/L）麻醉，每尾草魚腹腔注射TCID50為1×106的GCRV 0.1 mL，對照組每尾注射同等劑量的滅菌生理鹽水。于注射后1、2、3、5、7 d取樣，每組隨機選取4尾試驗魚，用MS222（1 mg/L）麻醉后，取其肝臟、脾臟、腎臟，用Trizol提取各組織RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用Real-time PCR方法測定肝臟、脾臟、腎臟中的病毒含量。
1.7數(shù)據(jù)分析
熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，查看擴增曲線和Ct值等；通過標準曲線換算得到樣品中內(nèi)參基因β-actin和病毒基因組的絕對拷貝數(shù)，再經(jīng)β-actin校正得到相應(yīng)的相對拷貝數(shù)。
2結(jié)果
2.1 Real-time PCR檢測方法的建立
用特異性熒光定量引物VP6-U/VP6-L對病毒核酸進行PCR擴增，將得到的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)擴增片段與預期大小（102 bp）一致，且特異性好（圖1）。將擴增片段克隆到pMD-18T后送測序，發(fā)現(xiàn)序列與Genebank上公布的序列一致。從不同稀釋度的標準品Real-time PCR擴增反應(yīng)（圖2）可以看出，從1×101～1×106個拷貝數(shù)的質(zhì)粒擴增曲線均呈“S”型，且與指數(shù)增長期的擴增曲線平行，反映出PCR的擴增效率相近，檢測靈敏度為1×101個病毒粒子。以質(zhì)粒拷貝數(shù)的對數(shù)為X軸，以Ct值為Y軸，根據(jù)兩者的相關(guān)性得到標準曲線Y=3.237×log（X）+39.63，其相關(guān)系數(shù)R2為0.999，擴增效率為103.7%。特異性試驗結(jié)果顯示（圖3），GCRV病毒核酸擴增曲線呈“S”型，而IHNV、SVCV及陰性對照均沒有擴增曲線，說明所建立的檢測方法特異性好。
圖1引物VP6-U、VP6-L PCR擴增結(jié)果
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