基于革蘭氏陽性菌生長曲線等指標評價纖維素基抑菌材料L-Met改性MCC（M-MCC）抑菌效果（三）
1.3.5.3 M-MCC處理下細菌生長曲線測定
分別以1 MIC和2 MIC的M-MCC為處理組，空白組不加入抗菌劑，向其中分別加入200μL濃度為106 CFU/mL的菌懸液，置于恒溫培養箱中37℃，每2 h在600 nm波長處用酶標儀測定OD600 nm，并記錄數據，繪制細菌生長曲線。
1.3.5.4 M-MCC對細胞膜通透性的影響測定
將培養24 h的L.monocytogenes和S.aureus在8 000 r/min離心15 min，收集細胞沉淀，用無菌生理鹽水洗滌兩次，重懸至OD600 nm＝0.6～0.8，作為初始菌溶液備用。以2 mL L.monocytogenes菌懸液+2 mL無菌葡萄糖水為空白對照組，以2 mL菌懸液+2 mL無菌葡萄糖水+2 MIC的M-MCC為1 MIC組，以2 mL菌懸液+2 mL無菌葡萄糖水+4 MIC的M-MCC為2 MIC組。于37℃恒溫培養6 h。在8 000 r/min將不同培養時間的混合液分別離心15 min，保留上清液，過0.22μm的濾膜，并用電導率儀測定過濾后上清液的電導率。
1.3.5.5 M-MCC對細胞內容物的影響測定
通過測定細菌細胞核酸及蛋白質的泄漏情況確定M-MCC對細菌細胞內容物的影響，其中利用紫外分光光度計在260 nm波長處測定核酸吸收峰，在280 nm波長處測定蛋白質吸收峰。
將培養24 h的L.monocytogenes和S.aureus在8 000 r/min離心15 min，并收集細胞沉淀，用無菌PBS洗滌兩次，重懸至OD600 nm＝0.6～0.8，作為初始菌溶液備用。以4 mL菌懸液為空白對照組，以4 mL菌懸液+MIC的M-MCC為1 MIC組，以4 mL菌懸液+2 MIC的M-MCC為2 MIC組。于37℃恒溫培養0、30、60、90、120、150、180 min。在8 000 r/min將不同培養時間的混合液分別離心15 min，保留上清液，過0.22μm濾膜，使用紫外分光光度計分別測定260 nm和280 nm波長處的吸光度。
1.3.5.6 M-MCC對細胞DNA含量的影響測定
將培養24 h的L.monocytogenes和S.aureus在8 000 r/min離心15 min，并收集細胞沉淀，用無菌PBS洗滌兩次，重懸至OD600 nm＝0.6～0.8，作為初始菌溶液備用。以2 mL菌懸液為空白對照組，以2 mL菌懸液+MIC的M-MCC為1 MIC組，以2 mL菌懸液+2 MIC的M-MCC為2 MIC組。于37℃恒溫培養4 h。向各組中加入20μL 1 mg/mL的DAPI，充分混勻并在遮光條件下反應10 min。取20μL溶液滴加至載玻片上，加蓋玻片，通過激光共聚焦顯微鏡（64×）進行觀察，激光共聚焦顯微鏡的激發波長設置為405 nm，發射波長設置為461 nm。
1.4數據處理
實驗數據及圖由Excel 2021軟件和Origin 2021 Pro軟件處理。
2結果與分析
2.1表征分析結果
2.1.1微觀形貌及結構分析
為了了解L-Met修飾對MCC形貌結構的影響，觀察MCC和M-MCC的微觀形貌和結構變化，采用SEM對MCC和M-MCC成像，結果如圖2所示。與具有多孔結構、呈現短棒狀的MCC相比，L-Met修飾的M-MCC表現出更粗糙的表面，呈片狀分布，且表面覆蓋有顆粒狀纖維。這種表面結構改變可能有助于增加M-MCC對細菌的接觸面積，進而提高抗菌活性，這有待進一步的確定。
圖2 MCC與M-MCC的微觀形貌
2.1.2表面官能團及元素分析
使用FTIR對改性前的MCC和改性后的M-MCC表面官能團進行表征，結果如圖3所示。在3 337、1 634、1 430、1 320、1 166 cm-1和1 031 cm-1處MCC和M-MCC具有相同的峰，分別對應—OH拉伸振動峰、—OH彎曲振動吸收峰、—H—C—H—面內彎曲振動峰、—O—C—H面內彎曲振動峰、—C—O—C—不對稱拉伸振動峰和—C—O—拉伸振動峰，這證明改性后MCC骨架結構不變，說明L-Met的接枝并沒有破壞纖維素的基本骨架結構。—C—S—C—的紅外吸收峰出現在1 024 cm-1處，1 630～1 680 cm-1碳氧伸縮振動和1 460～1 550 cm-1氮氫彎曲振動證明了酰胺鍵的存在，間接證明了L-Met成功接枝到MCC表面。
圖3 MCC和M-MCC的FTIR
為了進一步了解M-MCC的元素分布情況，采用SEM-EDS和XPS分別對C、O、N、S進行元素分析。M-MCC中的元素分布情況如圖4A所示，包含C、O、N、S的EDS總譜圖如圖4B所示，可以看出，在M-MCC上可以檢測到N、S元素，而這兩種元素MCC本身不具備，由于L-Met接枝負載在MCC上而出現，這證明L-Met成功接枝到了MCC上。在能譜總譜圖中能夠觀察到N、S的特征峰，也證明了這一結論。
圖4 M-MCC的表面官能團分析
如圖4C所示，M-MCC由于分子中N、S元素含量較少，全譜分析中并未能直接看到N元素（N1s）和S元素（S2p）的結合峰。M-MCC的C1s結合能為286.11 eV，O1s結合能為532.5 eV。進一步對N1s和S2p的特征譜峰進行精細掃描分析，由峰形可以判斷出N、S元素的存在，但其較小的峰面積和峰強度也證實了N、S元素在M-MCC中含量較低。M-MCC的原子百分比如表1所示。由XPS所得到的N、S元素在M-MCC上的原子百分比僅為0.94%和0.55%，而C、O元素原子百分比則高達57.61%和40.91%。
表1 M-MCC的元素分析
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