轉錄水平解析昆蟲病原線蟲共生菌菌株新型殺菌蛋白PPIA-L20基因表達調控——?討論與結論
3討論與結論
本課題組前期從Xenorhabdus bovienii NN6菌株胞外蛋白中分離出一種抑菌蛋白PPIA-L20，為肽基脯氨酰異構酶A類似物，該蛋白對鐮刀菌屬真菌具有極強的抑制效果。本研究發現ppia-l20基因表達水平不隨發酵時間變化而變化，與發酵時間沒有相關性，而胞外抗菌蛋白濃度隨發酵時間增加而增加。采用轉錄組測序技術發現，基因ppia-l20在不同表達水平情況下，差異表達基因主要涉及細胞膜相關功能、次級代謝產物合成、氨基酸合成、雙組分調節系統和鞭毛合成相關通路。這表明ppia-l20表達受到多種生物途徑的共同調節，在發酵過程中呈現動態表達現象。
在本研究中，GO分析結果顯示差異基因主要歸屬于代謝過程、定位、膜等功能分類。KEGG富集通路預測結果與次級代謝產物合成、雙組分調節系統相關通路、鞭毛組裝與磷酸轉移酶系統通路相關。腸桿菌科中，陽離子抗菌肽能夠激活磷酸傳導系統中rcsB基因，激活信號傳遞給下游的ppia-l20，激活相關基因表達并輔助蛋白折疊進行膜修飾等一系列應激反應以抵御抗菌肽的侵襲。本研究中，KEGG富集基因位于雙組分調節系統通路中，磷酸傳導系統中rcsB基因激活，雙組分調節系統通路中的關鍵基因ompR顯著上調，kdpc、kdpB作為反應調節因子顯著上調。在鼠傷寒桿菌中，磷酸傳導系統PhoPQ通過促進PmrD蛋白的表達來控制PmrAB信號，PmrD蛋白與磷酸化的PmrA結合并阻止去磷酸化，導致PmrA調控基因的激活。PhoQ結構與功能息息相關，PhoQ的陰離子結合位點朝向內膜，其位置有利于與膜表面的陽離子AMPs相互作用。AMPs可能被位于內膜(IM)內部脂蛋白感知，從而導致rcsBCD激活，其機制尚不清楚。本研究中，雙組分調節系統相關基因和磷酸轉移系統rcsB基因的激活，可能與外部環境中的陽離子抗菌肽刺激相關。DEG富集通路包括雙組分調節系統相關通路和磷酸轉移酶系統，細菌雙組分系統通過磷酸化級聯反應，通過傳感器激酶和反應調節因子NlpE蛋白控制基因表達，幫助維持革蘭氏陰性細菌外膜(OM)完整性。這與GO分析中的細胞膜功能相關蛋白的表達相吻合。本研究結果表明，nlpE基因顯著下調，NlpE蛋白同時存在于PPIA-L20蛋白共同通路(陽離子抗菌肽抵抗通路)的上游，可能起到調控ppia-l20基因表達的作用。
鞭毛分泌系統的基因普遍下調，主要調控鞭毛調節器flhDC在運動協調中的作用，在嗜線蟲致病桿菌X.nematophilila中，反應調節基因ompR或同源組氨酸激酶基因envZ失活后，抗生素產生和位于鞭毛基因簇附近的nrps1基因的表達水平均升高。ompR/envZ在抗菌物質和毒力因子產生過程中起到負向調控的作用。已有研究證明，在嗜線蟲致病桿菌X.nematophilila中，細菌素復合體等外泌蛋白通過鞭毛Ⅲ型分泌系統(T3SS)輸出，鞭毛轉錄調節因子也可以通過調節毒力因子的表達來促進毒力的發揮，鞭毛轉錄調節因子fliZ能夠直接或間接上調編碼殺蟲毒素和抗菌化合物(XcnA-N、PaxABCT)的基因的表達。本研究中，fliZ基因顯著下調，與ompR/envZ基因顯著上調共同調控抗菌蛋白基因的表達結果一致。通過構建蛋白互作網絡發現，與ppia-l20基因位于共同通路上的nlpE基因表達蛋白與雙組分調節系統中cpxR基因表達蛋白具有互作關系，cpxR基因位于ppia-l20基因上游，與磷酸傳導系統中rcsB基因起到共同調控的作用。
綜上所述，ppia-l20基因表達可能受到陽離子抗菌肽抵制通路中的關鍵蛋白NlpE脂蛋白以及雙組分調節系統和磷酸轉移系統共同調節。ppia-l20基因表達的抗真菌蛋白有巨大的開發價值，同時該基因在菌株受到外界抗生素刺激時也發揮重要作用。本研究首次對ppia-l20基因不同表達水平下的Xenorhabdus bovienii菌株進行轉錄組測序，分析了可能影響ppia-l20基因表達水平相關的通路，以及ppia-l20基因不同表達水平下相關差異表達基因的變化趨勢與其功能之間的關系，為進一步探索基因表達調控機制提供參考，并為高效開發抗真菌生防制劑奠定理論基礎。