生食大眼金槍魚中生物胺產生菌分離純化、菌落總數、生長曲線及形狀鑒定（三）
2.4生物胺生成情況分析
為進一步確認這9株菌的產胺能力，將9株菌株分別接種到TSB培養基中，30℃培養3 d，分析培養液中生物胺產生質量濃度，結果如表2所示。由表2可知，9株菌均可產生色胺、腐胺和尸胺，菌株B-9生物胺生成能力較其他菌株最弱，總質量濃度為2.78 mg/L。B-1、B-3和B-7的產胺能力較強，總生物胺質量濃度分別為40.4、41.3和50.3 mg/L。其中B-1的色胺產生質量濃度最高，為38.9 mg/L；B-3亞精胺產生質量濃度最高，為31.2 mg/L；B-7酪胺產生質量濃度最高，為38.5 mg/L。
表2菌株的生物胺生成情況
a-9株菌株在0℃下的生長曲線;b-9株菌株在30℃下的生長曲線
圖2九株菌株在0℃和30℃下的生長曲線
2.5生物胺產生菌的形態特征
將3株產胺量最高的菌株進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察。從顯微鏡下觀察到B-1為革蘭氏陰性菌，菌落形態為乳黃色圓形凸起菌落，邊緣整齊，菌株為球狀菌，無芽孢。B-3為革蘭氏陰性菌，菌落形態為圓形，表面光滑不透明，乳黃色，邊緣整齊，菌株為桿狀菌，無芽孢。B-7為革蘭氏陽性菌，菌落形態為白色凸起，邊緣整齊，表面光滑圓潤，菌株為球狀菌，無芽孢。
2.6生物胺產生菌的鑒定
2.6.1生理生化實驗鑒定
VITEK 2鑒菌儀是通過將檢測菌株的各項生理生化實驗反應結果與已知的菌株數據庫作比較，從而推測菌株的可能性概率，可信概率范圍為85.0%～99.0%。經鑒定，3株菌株的生理生化實驗結果如表3所示。鑒定B-1菌株為巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)，可信概率為99.0%；B-3菌株為產堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)，可信概率為97.0%；B-7菌株為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，可信概率為99.0%。
表3菌株鑒定結果
2.6.2 16S rDNA鑒定
瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物圖片結果如圖3所示，電泳可成功擴增出預期的DNA片段，且2 000 bp處擴增條帶清晰明亮，所以該PCR片段可同時作為后續PCR反應中的引物和模板，送檢測序。
圖3三株菌株的瓊脂糖凝膠電泳圖
將測序結果與NCBI數據庫進行比對，并建立系統進化樹，結果如圖4所示。從比對結果可知，樣本B-1與溶酪巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)親源關系最近，樣本B-3與產堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)親源關系最近，樣本B-7與糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)親源關系最近。由于溶酪巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)為細菌致病菌，可引起一些水產動物大量死亡，推斷B-1來自外界環境，并隨著貯藏時間的增加，逐漸成為金槍魚腐敗菌中的優勢菌種。產堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)是人和動物腸道的正常菌群，但由于金槍魚體型較大，腸道污染可能性較小，因此推斷B-3與B-7同樣來自外界環境。
圖4基于16S rDNA序列構建的進化樹
3結論
本研究利用生物胺初篩培養基結合高效液相色譜技術，從大眼金槍魚生魚片中篩選出9株生物胺產生菌，其中3株產胺量最高的菌株分別為溶酪巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)、產堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)。溶酪巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)和產堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)均屬于新發現的生物胺產生菌。糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)曾被LADERO等從乳制品中分離得到。產堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)能夠引起人體食物中毒、嚴重的腸胃炎、腹瀉等疾病，對人體健康有潛在的危險性。
研究表明，根據產胺菌的生物學特性，可通過抑制相關菌群和低溫貯藏相結合的方法來控制生物胺的生成，保證大眼金槍魚的品質和食用安全性。
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