DAPI熒光染色計數(shù)法：不同保藏方式時間對海洋微型底棲生物計數(shù)結(jié)果的影響——結(jié)果、結(jié)論
2結(jié)果
2.1站位基本情況
實驗中5個站位(3205、3403、4018、3400-8、3800-1)的環(huán)境因子見表1。
表1五個站位3205、3403、4018、3400-8、3800-1的環(huán)境因子
圖2 DAPI染色后的細菌(2-1)、硅藻(2-2,2-3)、鞭毛蟲(2-4～2-7)及藍細菌(2-8)
2.2保藏方式實驗
利用DAPI染色,對三站位(3205、3403、4018)0～2 cm分層的冷凍、冷藏樣品進行分析。熒光鏡檢觀察到細菌及各種原生生物的形態(tài)如圖2所示,細菌大小約為1～2μm,常見為球菌、桿菌、弧形菌;硅藻種類多樣,有圓篩藻、曲舟藻、直鏈藻等,常見10μm大小的直鏈藻;鞭毛蟲形態(tài)多種多樣,有球形,橢球形等,個體大小差異也較大;藍細菌多為2個或4個一組存在。
圖3示3205、3403、4018站冷凍、冷藏兩種保藏方式下各類群的豐度。三個站位冷凍樣品中細菌平均豐度為8.69×108±2.92×108個/mL,較冷藏樣品低25%(平均1.16×109±0.31×109個/mL),2～5μm的鞭毛蟲平均豐度為4.00×106±0.97×106個/mL,較冷藏樣品低25%(平均5.39×106±1.92×106個/mL),5～10μm的鞭毛蟲平均豐度為5.07×105±3.06×105個/mL,較冷藏樣品低23%(平均6.61×105±3.06×105個/mL),＞10μm的鞭毛蟲平均豐度為4.50×104±4.82×104個/mL,較冷藏樣品低79%(平均2.18×105±1.38×105個/mL),硅藻平均豐度為8.35×104±7.71×104個/mL,較冷藏樣品低13%(平均9.63×104±13.9×104個/mL),藍細菌平均豐度為2.56×106±0.75×106個/mL,較冷藏樣品高9%(平均2.35×106±0.86×106個/mL)。沉積物中細菌在豐度(108～109)上占絕對優(yōu)勢(冷藏冷凍樣品98.84%～99.35%),冷藏保存下4018站的細菌豐度最高;其次是自養(yǎng)小鞭毛蟲(豐度占0.32%～0.57%)、藍細菌(豐度占0.12%～0.40%)、異養(yǎng)小鞭毛蟲(豐度占0.02%～0.25%),硅藻豐度所占比例最小(0～0.02%)。三個站位沉積物樣品中相同粒級的自養(yǎng)小鞭毛蟲的豐度均高于異養(yǎng)小鞭毛蟲。自養(yǎng)小鞭毛蟲豐度4018站最高,其次是3403站、3205站。按鞭毛蟲大小看,2～5μm鞭毛蟲的豐度最高,5～10μm鞭毛蟲豐度次之,＞10μm鞭毛蟲豐度最小。
T-test檢驗結(jié)果表明,冷凍、冷藏兩種保藏方式下,3205站和3403站的各測試對象：細菌、硅藻、藍細菌、自養(yǎng)小鞭毛蟲、異養(yǎng)小鞭毛蟲均無差異;4018站的細菌、硅藻、藍細菌、異養(yǎng)小鞭毛蟲及PNF(＞10μm)均無差異,而PNF(2～5μm)、PNF(5～10μm)存在顯著差異(P＜0.05),PNF(2～5μm)冷藏樣品豐度顯著高于冷凍樣品92.1%,PNF(5～10μm)冷藏樣品豐度顯著高于冷凍樣品89.5%(表2)。
圖3冷凍及冷藏兩種保藏方式下3個站位(3205、3403、4018)的細菌(a)、硅藻(b)、藍細菌(c)、自養(yǎng)小鞭毛蟲(d)和異養(yǎng)小鞭毛蟲(e)的豐度
2.3保藏時間實驗
為研究不同保藏時間對細菌及各原生生物類群定量計數(shù)的影響,對來自黃海的兩個站位(3400-8及3800-1)0～2 cm及2～5 cm分層的樣品經(jīng)保存1個月和4個月后的對比分析見表3。兩個站位的各類群中,細菌豐度均超過99%,自養(yǎng)小鞭毛蟲占0.42%,異養(yǎng)小鞭毛蟲、藍細菌,硅藻所占比例最小。在保存1個月和4個月后各類群所占的百分比基本保持穩(wěn)定。統(tǒng)計分析表明,不同保存時間下,3400-8及3800-1站的兩個分層的細菌、藍細菌、PNF(5～10μm)、PNF(＞10μm)、HNF(＞10μm)和硅藻均無差異。3400-8站兩個分層的HNF(2～5μm)均有顯著差異,保存4個月后鏡檢均未檢獲到;而PNF(2～5μm)和HNF(5～10μm)均無差異。3800-1站0～2 cm分層的PNF(2～5μm)和HNF(5～10μm)均有顯著差異,保存4個月后PNF(2～5μm)的豐度比1個月時減少了47.4%,HNF(5～10μm)未檢獲到;2～5 cm分層的PNF(2～5μm)、HNF(2～5μm)均有顯著差異,保存4個月后PNF(2～5μm)豐度比1個月時減少了59.6%,HNF(2～5μm)未檢獲到(表3和表4)。
表2不同保藏方式下3205、3403、4018站位的0~2cm分層細菌,藍細菌及原生生物的T-Test檢驗
3討論
3.1保藏方式對定量的影響
Porter等報道福爾馬林固定后的浮游樣品經(jīng)DAPI染色封片后,4℃保存24周,細菌計數(shù)結(jié)果無差異。Hyun等研究發(fā)現(xiàn)浮游樣品采集后經(jīng)福爾馬林固定,一部分存于樣品瓶中,一部分現(xiàn)場染色封片,均冷凍保存90天。結(jié)果顯示存于樣品瓶后的細菌數(shù)量為原來的95%,而封片中細菌數(shù)量為原來的80%,且反復凍融可造成細菌數(shù)量損失。但有關底棲樣品保藏后對實驗結(jié)果的影響研究極少。本研究三個站位中,對于細菌、藍細菌、硅藻、三個粒級的異養(yǎng)小鞭毛蟲以及大于10μm的自養(yǎng)小鞭毛蟲,冷凍、冷藏兩種保藏方式無差異;而對于2～5μm與5～10μm的自養(yǎng)小鞭毛蟲來說,在一個站位呈現(xiàn)差異顯著,冷藏獲得的豐度高于冷凍保藏。原因可能在于冷凍樣品的解凍過程對細胞尤其是較大個體的細胞造成破碎,解凍對于細胞壁較為堅實的細菌和藍細菌的影響較小,而對于細胞壁不太堅實的鞭毛蟲則影響較大。因此,對沉積物樣品短期內(nèi)宜采用避光冷藏保存。此外,沉積物類型的不同,也會對定量計數(shù)造成影響：例如,含砂量較多的樣品過濾到黑膜上后,可造成細胞分布不均或鏡檢時焦距不同而影響計數(shù),而含泥較多則會遮掩部分細菌及小的原生生物。
表3兩站位(3400-8,3800-1)的0~2 cm及2~5 cm分層樣品在保存1個月和4個月后的細菌、藍細菌及原生生物的豐度
表4兩站位(3400-8,3800-1)的0~2 cm及2~5 cm分層在保存1個月和4個月后的細菌及原生生物的T-Test檢驗結(jié)果
3.2樣品保存時間對定量的影響
在樣品保存時間對底棲生物定量分析的影響方面,迄今尚無研究報道。Daley等、Sherr等及Kepner等發(fā)現(xiàn)經(jīng)福爾馬林固定的浮游樣品于5℃下避光保存1～2周后,對細菌的計數(shù)結(jié)果無差異。Turley曾報道經(jīng)戊二醛固定后的浮游樣品常溫避光保藏,前40天內(nèi)細胞數(shù)量平均減少39%,并證實無論以何種固定液(戊二醛或甲醛)、樣品瓶(無色或棕色瓶)或染色劑(AO或DAPI)處理,均會造成細胞數(shù)量的低估。本研究表明樣品隨著保存時間的延長(保藏1個月和4個月),對其定量計數(shù)依不同研究對象而有程度不同的影響：對于細菌、藍細菌、PNF(5～10μm)、PNF(＞10μm)、HNF(＞10μm)、硅藻保存4個月后計數(shù)無影響;而對于PNF(2～5μm)、HNF(2～5μm)、HNF(5～10μm)的影響不同,例如樣品保存4個月后,在3800-1站0～2 cm分層的PNF(2～5μm)豐度比1個月時減少了47.4%,2～5 cm分層的豐度減少了59.6%,而且統(tǒng)計分析存在差異的HNF(2～5μm)和HNF(5～10μm)在4個月后豐度降為0。可見樣品保藏時間對異養(yǎng)小鞭毛蟲的影響比自養(yǎng)小鞭毛蟲的影響大。總體上,樣品保藏4個月對細菌、藍細菌、硅藻均無影響,但對鞭毛蟲有一定的影響,因此建議對鞭毛蟲樣品在采集后宜盡快分析。
4結(jié)語
冷凍和冷藏兩種保藏方式對于細菌、藍細菌和硅藻的影響未呈現(xiàn)明顯差異,但對于自養(yǎng)小鞭毛蟲則冷藏優(yōu)于冷凍方式,故建議短期內(nèi)對沉積物樣品采取避光冷藏保存,并在采集后盡快完成樣品的定量分析。
致謝：本研究樣品源于“中國科學院海洋研究所2007年度黃海冷水團調(diào)查航次”。杜永芬、代仁海、詹子鋒協(xié)助采樣,李承春協(xié)助部分樣品處理,在此一并致謝。