?懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長曲線的繪制
懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長曲線的繪制
以三種不同細(xì)胞濃度進(jìn)行系列細(xì)胞培養(yǎng)，每天計數(shù)細(xì)胞直至平臺期。
無菌
懸浮細(xì)胞培養(yǎng)
培養(yǎng)液，l00 ml
D-PBSA(細(xì)胞計數(shù)用）
24孔板
非無菌
裝培養(yǎng)板的塑料盒
CO2溫箱或5%C02以充盈塑料盒
懸浮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：
1.直接傳代法：
1)打開培養(yǎng)皿（瓶）蓋（蓋放在“非工作區(qū)”，蓋、培養(yǎng)皿口不能接觸任何物品）；
2)按照傳代比例加入適當(dāng)體積的新鮮的完全培養(yǎng)基，小心吹打成細(xì)胞懸液，再按照傳代比例，等分裝入新的培養(yǎng)皿（瓶）中；
3)蓋好蓋子，混勻，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2.離心傳代法：
1)打開培養(yǎng)皿（瓶）蓋（蓋放在“非工作區(qū)”，蓋、培養(yǎng)皿口不能接觸任何物品）；
2)將細(xì)胞懸液用移液槍或巴氏吸管吸至新的15mL離心管中；
3)1500rpm離心3min，棄上清，加入適當(dāng)體積的新鮮的完全培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液，按比例進(jìn)行傳代，將細(xì)胞懸液分配至新的培養(yǎng)瓶（皿）中，補(bǔ)足完全培養(yǎng)液；
4)蓋上蓋子，混勻，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
3.收培養(yǎng)基、胰酶等，75%酒精擦拭操作臺面，關(guān)閉生物安全柜；
4.沖洗廢液缸。
操作步驟
1.如單層培養(yǎng)那樣（見方案21.8)將生長液中的細(xì)胞懸液以不同濃度加人到孔中。
2.以不同時間從三孔中取樣0.4 ml，注意細(xì)胞要充滿混勻以及完全分散成單個。
3.用電子細(xì)胞計數(shù)器汁數(shù)（見21.1.2節(jié)）或用血球計數(shù)器計數(shù)（見21.1.1節(jié))。
4.計算每個樣本的細(xì)胞濃度，像單層細(xì)胞生長一樣以時間作對數(shù)線性作圖（見21.9.3節(jié)）。細(xì)胞密度不適用于懸浮培養(yǎng)，因?yàn)樗鼈儾粫N附。
提示接種2個75 cm2培養(yǎng)瓶，每瓶20 ml不同農(nóng)度的細(xì)胞懸液。按需要每天從瓶中取0.4 ml，但取樣前要混勻細(xì)胞。培養(yǎng)瓶離開溫箱的時間要盡量短，在畫生長曲線期間不要換培養(yǎng)液?；蛘邔⑴囵B(yǎng)瓶裝在振蕩器上（Techne，Integra，BeHco)，每天取樣。如果用振蕩培養(yǎng)瓶在一側(cè)瓶口封膜，則不用從溫室中取出培養(yǎng)瓶，也不用打開封口膜就可以取樣，將膜面擦凈，顛倒一下瓶子用注射器就可將液體吸出。
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