根際細菌菌株可提高辣、及花生種子發芽率，促進幼苗生長
3結果與分析
3.1 3株茶樹根際細菌浸種對辣椒種子萌發及幼苗生長的影響
利用從茶樹根際分離、篩選到的3株細菌菌株GD 3、KKS-6-N 1及P 5對辣椒進行浸種試驗，萌發后于盆栽條件下繼續生長30 d后測定幼苗的相應生長指標。以3株細菌菌液進行了2 h的浸種處理后，辣椒種子的萌發率均在90%左右，較對照顯著提高了近20%，但不同菌株處理之間并無顯著性差異(p<0.05)。30 d的盆栽實驗表明，與對照相比，GD 3、KKS-6-N 1、P 5浸種處理的辣椒幼苗鮮重分別增加54.55%、63.64%和45.46%，株高分別增長85.14%、75.23%和84.69%，根長分別增長了69.51%、13.17%和129.76%。顯然，3株茶樹根際細菌的浸種處理使辣椒種子的發芽率明顯提高，且對辣椒的株高和鮮重具有顯著促生作用；其中，P 5浸種處理的植株根長明顯高于對照及其余2個菌株的處理。
3.2 3株茶樹根際細菌浸種對花生種子萌發的影響
利用3株茶樹根際細菌菌株對花生進行相同的浸種處理，3 d后統計種子的萌發率(圖1)，結果發現，菌劑浸種處理組的發芽率均在90%以上，較對照種子的發芽率提高了20%以上，3株細菌菌株對種子的萌發具有明顯的促進效果，但不同菌株處理之間對種子萌發率并無顯著差異(圖1)。
圖1 3株茶樹根際細菌對花生種子萌發的影響
3.3 3株茶樹根際細菌灌根處理對花生幼苗生長的影響
為了進一步探討根際細菌對花生幼苗生長的影響作用及內在機制，分別利用3株菌液進行灌根處理，培育30 d后測定花生的生長性狀(表2)，發現3株菌株對花生幼苗生長的影響呈現一定差異。與對照相比，GD 3、KKS-6-N 1、P 5灌根處理的花生幼苗鮮重分別增長4.63%、26.83%和35.12%，株高分別增加了5.99%、16.22%和32.73%，根重分別增長21.62%、29.73%和35.14%。生理指標的測定結果顯示，GD 3和KKS-6-N 1接種組的葉綠素含量略低于對照，而P 5接種組的葉綠素含量較對照提高了13.47%。結果(圖2)表明，P 5菌株的灌根處理對花生幼苗的促生效果顯著，其次為KKS-6-N 1。
表2 3株茶樹根際細菌對花生幼苗生長的影響
3.4 P 5菌株灌根處理對花生植株營養元素的影響
由于P 5菌株可以顯著促進花生幼苗鮮重和株高的增加，因而經P 5灌根處理的花生植株進行了營養指標測定(表3)，發現接種組植株的全氮增高了13.56%，與對照呈現顯著差異；全鉀含量略有提升，但差異不明顯，而全磷含量基本無改變(p<0.05)。
注：圖左3株花生為P 5菌株處理，圖右3株為ck。圖2根際促生菌菌株P 5對花生幼苗生長的影響
表3根際促生菌菌株P 5對花生植株營養元素的影響
3.5 P 5菌株灌根處理對花生根際土壤三大菌群和功能菌群數量的影響
由于土壤微生物在土壤營養物質循環及維持土壤肥力方面起著重要作用，實驗擬進一步從土壤菌群數量和土壤酶活入手，解析該菌株對花生的促生機制。對P 5菌株灌根處理的花生根際土壤及對照土壤進行三大菌群總數的測定(表4)，結果發現，處理組根際土壤中的細菌總數較對照增長了2.63倍，真菌總數增長了2倍，細菌數/真菌數之比增加了1.32倍，菌劑處理使得細菌和真菌數量較對照呈現顯著差異，而放線菌總數并無明顯差異(p<0.05)。由于P 5處理后的花生根際土壤中細菌總數顯著提高，因而對根際土壤中與促生相關的功能菌群數量進行了測定(表4)，發現氨化細菌及固氮菌數分別較對照增高了2倍和2.44倍，溶磷菌數增高了4.07倍，與土壤氮磷含量直接相關的氨化細菌、固氮菌及溶磷菌數均明顯高于對照，而解鉀菌數略有下降，但差異不顯著(p<0.05)。
3.6 P 5菌株灌根處理對花生根際土壤酶活性的影響
酶活性的測定結果(表5)顯示，與對照相比，處理組根際土壤的蔗糖酶活性增加了1.41倍，過氧化氫酶活性增長了2.65倍，脲酶增長了2.33倍，中性磷酸酶活性基本無改變，表明P 5浸種處理的花生根際土壤中，蔗糖酶、過氧化氫酶及脲酶酶活性均較對照有顯著提高(p<0.05)。
表6 P 5菌株的16 S rRNA基因相似性比對
圖3 P 5菌株的16 S rRNA基因系統發育樹
表4根際促生菌菌株P 5對花生根際土壤三大菌群數量(cfu·g-1)的影響
表5根際促生菌菌株P 5對花生根際土壤酶活性的影響
3.7 P 5菌株的分子鑒定及系統發育樹的構建
利用細菌16 S rRNA基因的通用引物對27 F/1492 R對P 5細菌的總DNA進行PCR擴增，測序結果獲得1 405 bp的核苷酸序列，經NCBI網站上進行BLAST比對，發現與其一致性最高的菌株為克雷伯氏菌屬、變棲克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)，與該種A 6128菌株的16 S rRNA基因相似性為99.93%，此外與多株變棲克雷伯氏菌菌株及肺炎克雷伯氏菌NKU_Kleb 8 A 7菌株的相似性均為99.86%(表6)。與同屬內的不同種構建系統發育樹(圖3)，可見P 5菌株與Klebsiellavariicola的不同菌株聚于一大枝，且與該種DX 120 E菌株(CP 009274)的16 S rRNA基因在系統樹上相鄰，因而結合分子鑒定及系統發育樹，可將P 5菌株鑒定為Klebsiellasp.。
4結論與討論
本研究中使用的3株細菌菌株GD 3、KKS-6-N 1和P 5均是從茶樹根際分離篩選獲得的，浸種試驗表明，3株細菌均可使辣椒及花生種子的發芽率達到90%以上，較對照相比，發芽率可提高20%左右，對辣椒及花生種子的萌發均具有顯著的促進作用。在農業生產上，目前的花生栽培通常是種子經拌種或包衣后進行播種，利用菌劑進行種子包衣處理不失為一個提高種子萌發的有效方式。而辣椒種子常因成熟度不夠、采種技術不當或貯藏方法等原因造成發芽率降低[22]，研究結果為利用3株細菌菌劑進行拌種或包衣處理奠定了基礎。
但是，促進種子萌發的菌株不一定會對植株的生長有顯著促進作用。張振建等報道，烏拉爾桿菌PN 133和土壤根瘤桿菌Y 42的浸種均可使莧菜和油麥菜的發芽率提高，而灌根處理則促生效果并不明顯[23]。利用2株溶磷菌進行青稞種子的萌發試驗中，菌株10 BN-11對增加青稞發芽率及促進生長效果明顯，菌株12-BN-6對株高、根長和鮮重具有明顯的促進作用，但可抑制種子的萌發[24]。王艷燕等的研究發現，在9種可促進辣椒發芽率提高的菌株中，后續的穴盤育苗有促生效果的僅有4株菌，其中對辣椒下胚軸和主根長度影響顯著的GH 6-1和GH 5-3并未在苗期表現出顯著的促生作用，說明有些菌雖能促進種子萌發，但未必能在后期幼苗生長過程中促進其對養分的吸收[25]。本研究的浸種實驗雖顯示3株細菌均可明顯提高辣椒和花生種子的發芽率，且不同菌株的處理并無顯著差異；但辣椒種子萌發后的生長過程中，3株細菌對其后續的影響略有不一致；而且，在利用菌液的灌根處理中，發現P 5菌株對花生幼苗的促生效果顯著高于KKS-6-N 1，GD 3對幼苗株高及鮮重的影響則并不明顯，這也與報道的相一致。因而對于根際細菌促生作用的研究中，有必要分別對種子萌發和幼苗生長進行研究，綜合評判根際細菌菌株的促生作用。
研究顯示，根際促生菌可提高種子的發芽率和芽長，進而提高植株的生物量，但植物對所分離的功能菌株是否具有根際效應，是菌株發揮功能的關鍵[26]。康貽軍等在評價PseudomonaschlororaphisRA 6和BacilluspumilusWP 8浸種和拌土對豇豆生長的作用時，發現菌液的浸種處理及108cfu·g-1劑量的菌株拌土處理均可顯著提高豇豆的株高，認為浸種處理從原理上講，應該不會對非根際土壤產生較大影響[27]。Probanza等研究表明，PGPR對植物土壤中土著微生物數量及群落結構的影響可能是其促生的另一個機制[28]。研究表明，土壤酶活性與土壤速效養分密切相關，而土壤微生物數量大、繁殖快、活性強，直接影響到植物根際有機質的分解和養分的轉化[29]。因而，為了進一步解析和探究P 5菌株對花生幼苗生長的促進機制，本研究對接種P 5菌株的花生根際土壤進行了土壤微生物及酶活的測定。由于細菌、放線菌和真菌是土壤微生物的三大類群，構成了土壤微生物的主要生物量，它們的區系組成和數量變化能反映土壤生物活性水平[30]。
研究結果顯示，P 5處理組根際土壤中的細菌總數較對照增長了2.63倍，真菌總數增長了2倍，細菌總數/真菌總數之比增加了1.32倍，而放線菌總數并無明顯差異(p<0.05)。多數報道表明，接種促生菌均可不同程度地提高土壤細菌總數和放線菌數，降低真菌數量[31-33]。王興祥等研究認為，細菌型土壤是土壤肥力提高的一個生物指標，真菌型土壤是地力衰竭的標志[34]。但在巨尾桉接種固氮菌或解鉀菌的土壤中，發現細菌及放線菌數量增多，而真菌數量均不同程度的增高[35]。在研究中，真菌數量雖有明顯提高，但細菌數/真菌數之比仍高于對照，接種組土壤仍表現為細菌型土壤。土壤酶活性在一定程度上可以反映土壤肥力狀況。土壤蔗糖酶活性強弱能反映土壤的熟化程度和肥力水平[36]，過氧化氫酶活性與土壤呼吸作用及土壤微生物活動密切相關[37]，脲酶活性可在一定水平上反映土壤的供氮水平與能力[38]，磷酸酶在土壤有機磷向無機磷的分解轉化方面起著重要作用[39]。
研究顯示，除中性磷酸酶外，P 5接種組的根際土壤蔗糖酶、脲酶及過氧化氫酶均顯著高于對照，表明根際細菌P 5的處理活躍了土壤微生物；對功能菌群數量的進一步測定結果表明，氨化細菌數、固氮菌數及溶磷菌數顯著增高(p<0.05)。氨化細菌及固氮菌數量的顯著提高可以提供植物更多所需的氨氮，接種組植株全氮含量的明顯提高與土壤脲酶等酶活性的增高、氨化細菌及固氮菌數的顯著提升相一致，這顯然是促進花生生長的原因之一。
多項研究也已證實土壤酶活性與大豆、小麥及玉米產量呈顯著正相關關系[40-41]。此外，P 5菌株經分子鑒定為克雷伯氏菌屬，與KlebsiellavariicolaDX 120 E的同源性最高；而Klebsiellavariicola是2004年才發現的新種，作為內生菌，并由于其優良的固氮性能被報道[42-43]；本研究中的P 5菌株是具有一定固氮能力的茶樹根際細菌，因而接種了克雷伯氏菌屬的P 5菌株后，顯著提升了花生的全氮含量。值得注意的是，P 5菌株處理的花生全磷含量與對照基本無差異，這與根際土壤中性磷酸酶活無顯著變化相一致，而溶磷菌數明顯增高的原因還有待進一步研究。
綜上所述，Klebsiellasp.P 5菌株的浸種處理可以顯著促進辣椒和花生種子的萌發，灌根處理可以顯著促進花生幼苗的生長，植株的全氮含量明顯提高，這與根際土壤氨化細菌及固氮菌數量的顯著增多，土壤蔗糖酶、脲酶及過氧化氫酶活性的顯著增高直接相關，研究結果為下一步利用P 5菌株進行拌種或田間施用奠定了理論基礎。
相關新聞推薦
2、CSP-MDA-7/IL-24重組蛋白肝靶向肽-抗腫瘤肽的最佳表達條件（一）