新一代益生菌Akk在兩種培養(yǎng)基中的生長情況與差異性代謝組學(xué)分析結(jié)果（二）
2.3組間差異分析
本研究結(jié)合單變量統(tǒng)計(jì)分析和多維統(tǒng)計(jì)分析方法，篩選Akk在兩種培養(yǎng)基中的顯著性差異代謝物，對(duì)正、負(fù)離子模式下檢測到的顯著性差異代謝物進(jìn)行分析。
單變量統(tǒng)計(jì)分析
在進(jìn)行兩組樣本間的差異分析時(shí)，常用的單變量統(tǒng)計(jì)分析方法包括差異倍數(shù)（FC）分析、T檢驗(yàn)/非參檢驗(yàn)。基于單變量分析，對(duì)正、負(fù)離子模式下檢測到的所有代謝物（含未被鑒定的代謝物）進(jìn)行差異分析，篩選出FC＞1.5或FC＜0.67，P＜0.05的差異代謝物共902種，其中正離子模式下670種，負(fù)離子模式下232種。將這些差異代謝物用火山圖的形式表示，結(jié)果如圖4所示。
如圖4所示，每個(gè)圓圈代表一個(gè)特定的代謝產(chǎn)物，優(yōu)化后相對(duì)優(yōu)化前，紅色為顯著上調(diào)的代謝產(chǎn)物（FC＞1.5，P＜0.05），藍(lán)色為顯著下調(diào)的代謝產(chǎn)物（FC＜0.67，P＜0.05），圓圈越靠近左右兩邊和上邊，差異性越顯著，黑色為非顯著性差異代謝物。之后研究均針對(duì)紅色和藍(lán)色圓圈代表的顯著性差異代謝物。
多維統(tǒng)計(jì)分析
多維統(tǒng)計(jì)分析可以從總體水平反映組間差異以及組內(nèi)的變異度，常采用的方法包括PCA和OPLS-DA。將鑒定到的所有代謝物重新線性組合得到PCA模型，采用PCA方法，能從總體上反映樣本的總體分布趨勢和組件樣本的差異度。兩組樣本的PCA得分圖如圖5所示。
圖5中橢圓代表95%置信區(qū)間，同一顏色的點(diǎn)表示組內(nèi)的各個(gè)生物學(xué)重復(fù)，由點(diǎn)的分布狀態(tài)可以看出，該模型可以區(qū)分兩組樣本，組間樣本的數(shù)據(jù)點(diǎn)很好地集中在一起。PCA模型參數(shù)R2X越接近1表明模型越可靠，正、負(fù)離子模式下的模型解釋率R2X分別為0.835和0.855。結(jié)果表明該模型穩(wěn)定可靠，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，隨機(jī)誤差較小，可進(jìn)一步對(duì)樣本進(jìn)行差異性分析。
OPLS-DA得分圖及OPLS-DA置換檢驗(yàn)如圖6所示，t[1]能最大程度反映組間差異，而to[1]則反映組內(nèi)變異。可以看出OPLS-DA模型可顯著區(qū)分兩組樣本，且組內(nèi)差異較小，結(jié)果與PCA模型一致。經(jīng)7次循環(huán)交互驗(yàn)證得到模型評(píng)價(jià)參數(shù)R2Y、Q2，通常情況下Q2＞0.5即表明模型穩(wěn)定可靠。該模型正、負(fù)離子模式下的Q2分別為0.998、0.999，均大于0.5。在置換檢驗(yàn)中，隨著置換保留度逐漸下降，隨機(jī)模型的R2和Q2均逐漸下降，說明原模型不存在過擬合現(xiàn)象，模型穩(wěn)定性良好。
篩選差異代謝物
OPLS-DA模型得到的變量權(quán)重值（VIP）表示變量投影重要度，值越大，表示越重要。本實(shí)驗(yàn)以VIP＞1和P＜0.05為顯著性差異代謝物的篩選標(biāo)準(zhǔn)，正離子模式下篩選到670種顯著性差異代謝物，負(fù)離子模式下篩選到232種顯著性差異代謝物，由于篩選到的差異代謝物過多，且表格無法直觀地顯示這些代謝物的FC，因此，選擇VIP值前50的差異代謝物，以柱狀圖形式展示鑒定到的顯著性差異代謝物的FC變化，結(jié)果如圖7所示。可以看出，與硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基相比，Akk在優(yōu)化培養(yǎng)基中發(fā)酵后，正離子模式下22種代謝產(chǎn)物顯著上調(diào)，28種代謝產(chǎn)物顯著下調(diào)，負(fù)離子模式下顯著上調(diào)代謝產(chǎn)物22種，顯著下調(diào)代謝產(chǎn)物28種。后續(xù)將對(duì)這些顯著性差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。
2.4聚類分析
為了更全面直觀地顯示樣本之間的關(guān)系以及代謝物在不同樣本中的表達(dá)模式差異，將VIP值前50的顯著性差異代謝物用層次聚類進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖8所示。聚在同一簇內(nèi)的代謝物具有相似的表達(dá)模式，可能具有相似的功能或者共同參與同一代謝過程或者細(xì)胞通路。
Akk發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物中，顯著上調(diào)的代謝產(chǎn)物有肌酸、2-哌啶酮、2-氨基-1-苯乙醇、乙酰磷酸酯、煙曲霉素、巴多昔芬、N-乙酰-L-蛋氨酸、檸檬酸鹽、甘露糖和各種多肽等，這些代謝產(chǎn)物在人體疾病的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。文獻(xiàn)結(jié)果表明，Akk的這些代謝產(chǎn)物是該菌在緩解腸道炎癥，治療癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病主要功能因素。
顯著下調(diào)的產(chǎn)物有：烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、煙酰胺、高三尖杉酯堿、靈芝酸、尿苷、焦谷氨酸、海藻糖、龍膽苦苷等。其中，烏頭堿是有毒植物中存在的一種毒性成分—二萜類生物堿，毒性極強(qiáng)，具有心臟毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性、胚胎毒性，同時(shí)能通過血液吸收危害肝臟、腎臟等靶器官。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)化培養(yǎng)基中的烏頭堿顯著下調(diào)，說明Akk在優(yōu)化培養(yǎng)基中發(fā)酵能更大程度發(fā)揮預(yù)防及治療心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝臟疾病的作用。除此之外的Akk代謝產(chǎn)物均被發(fā)現(xiàn)有一定抗炎、抗腫瘤、抗肥胖等益生功效，但是優(yōu)化培養(yǎng)基中這些產(chǎn)物均有不同程度的下調(diào)，因此表明，補(bǔ)充Akk活菌制劑時(shí)應(yīng)注意其有效菌數(shù)，過多的活菌數(shù)可能帶來疾病風(fēng)險(xiǎn)。也有研究提出，補(bǔ)充滅活A(yù)kk可顯著改善超重/肥胖的胰島素抵抗者的多項(xiàng)代謝指標(biāo)，且安全性良好，效果優(yōu)于Akk活菌，由此為其作為后生元提供了有效證據(jù)。
2.5 KEGG通路注釋與分析
在生物體內(nèi)不同代謝物需要相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能，基于KEGG通路分析有助于更進(jìn)一步了解其生物學(xué)功能。為了解Akk在不同培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)物含量變化的機(jī)制，將正負(fù)離子模式下檢測到的顯著性差異代謝物整合后進(jìn)行KEGG通路注釋，并根據(jù)P值選擇顯著性最高的前20條KEGG通路進(jìn)行富集，富集結(jié)果以氣泡圖的形式顯示，結(jié)果如圖9所示。
富集最顯著的5個(gè)通路為蛋白質(zhì)的消化和吸收、氨酰基tRNA生物合成、膽汁分泌、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氨基酸生物合成。其中，蛋白質(zhì)的消化和吸收通路富集最為顯著，強(qiáng)調(diào)蛋白質(zhì)是Akk的第一營養(yǎng)需求，因此培養(yǎng)基優(yōu)化主要針對(duì)這一需求進(jìn)行。在這些通路中，蛋白質(zhì)的消化和吸收、膽汁的分泌是Akk消化系統(tǒng)中的代謝通路，氨酰基tRNA生物合成在Akk的遺傳信息處理中發(fā)揮重要作用，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白涉及到Akk的膜運(yùn)輸功能，對(duì)外界環(huán)境的信息進(jìn)行處理，氨基酸生物合成則可合成多種氨基酸。
除膽汁分泌通路外，其余4種代謝通路均富集到了多種氨基酸，人體所需的多種必需氨基酸包含其中，這些氨基酸均由培養(yǎng)基中的氮源即卵清蛋白和酪蛋白胨代謝得到。富集到膽汁分泌通路上的代謝物有20種，這些代謝物包括茚地那韋、依托泊苷、普伐他汀、多西紫杉醇、阿昔洛韋、烏本苷、長春花堿等，其中茚地那韋是一種選擇性、強(qiáng)效和特異性的HIV蛋白酶抑制劑，目前用于治療獲得性免疫缺陷綜合征，還能顯著減輕鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的阿爾茲海默癥（AD）相關(guān)的記憶缺陷，而相關(guān)研究表明，AD大鼠模型中，Akk可減輕AD大鼠的認(rèn)知障礙。依托泊苷、多烯紫杉醇、長春花堿等均為有效的抗腫瘤和抗癌藥物，可應(yīng)用于相應(yīng)的癌癥治療。此外一些研究也證實(shí)了Akk在肺癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌等的治療中發(fā)揮了重要作用。因此表明，其膽汁分泌通路可能是Akk發(fā)揮其功效的重要通路之一。
蛋白質(zhì)的消化和吸收通路中富集到了一種短鏈脂肪酸——丙酸，它除能維持腸道健康、緩解腸道炎癥外，在人體其他組織和器官中也可發(fā)揮重要作用，膳食中補(bǔ)充丙酸可通過抑制食欲提高胰島素敏感性，并增加能量消耗防止高脂飲食引起的肥胖。據(jù)報(bào)道，Akk在體外培養(yǎng)時(shí)主要代謝產(chǎn)物為丁酸和丙酸，而在優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵后丙酸呈現(xiàn)顯著上調(diào)，一方面說明該培養(yǎng)基更有利于Akk發(fā)揮改善腸道疾病、減肥等作用。但目前也有報(bào)道，機(jī)體內(nèi)有機(jī)酸累積與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)。由此也表明，腸道中Akk活菌數(shù)量應(yīng)保持一定上限，否則會(huì)帶來不良健康影響。
Akk發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基通過影響其代謝通路，這些代謝通路產(chǎn)生代謝產(chǎn)物較硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基顯著上調(diào)，一方面表明該培養(yǎng)基組分能使Akk更好地發(fā)揮抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、緩解腸道炎癥等益生功能，另一方面，顯著下調(diào)的代謝產(chǎn)物則從側(cè)面說明如果腸道內(nèi)Akk豐度過高可能帶來某些疾病風(fēng)險(xiǎn)，如增加骨關(guān)節(jié)炎及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等患病風(fēng)險(xiǎn)等，且如果人體本身患有腸道炎癥補(bǔ)充Akk活菌反而會(huì)加重病情。
結(jié)論
目前已知Akk與人體某些疾病存在重要關(guān)聯(lián)，但至今為止將其工業(yè)化高密度培養(yǎng)依然存在技術(shù)難題。本研究對(duì)硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，篩選出了適合工業(yè)化生產(chǎn)的培養(yǎng)基配方，并通過非靶向代謝組學(xué)技術(shù)比較分析了Akk發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基和硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物之間的差異，這些代謝產(chǎn)物與Akk發(fā)揮抗炎、抗癌、調(diào)節(jié)腸-腦軸和腸-肝軸等功能密切相關(guān)；將這些差異性代謝物進(jìn)行KEGG通路富集，發(fā)現(xiàn)Akk的蛋白質(zhì)消化和吸收通路富集最為顯著，證明了影響該菌生長的最重要因素是蛋白質(zhì)，同時(shí)也表明以此對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化的合理性。為該培養(yǎng)基在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用提供了依據(jù)，也為將來Akk高密度培養(yǎng)以及作為后生元的可能性提供了研究和應(yīng)用基礎(chǔ)。
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