10種有機(jī)物對(duì)氧化亞鐵硫桿菌BYM磁小體生長(zhǎng)、合成、發(fā)酵、產(chǎn)量的影響（三）
3、討論
A.ferrooxidans BYM在好氧條件下能夠以培養(yǎng)基中的FeSO4為底物進(jìn)行磁小體合成。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)這類細(xì)菌在一定程度上能夠吸收特定有機(jī)物轉(zhuǎn)化為細(xì)胞的生長(zhǎng)物質(zhì)，但是其同化能力有限[14]。研究發(fā)現(xiàn)，A.ferrooxidans BYM生長(zhǎng)和磁小體合成受到培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件的影響[28]。由于不同有機(jī)物可以調(diào)節(jié)亞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)，改變細(xì)胞膜通透性，從而達(dá)到促進(jìn)A.ferrooxidans BYM生長(zhǎng)的目的。因此，本研究以A.ferrooxidans BYM為目的菌株，分別添加10種不同濃度有機(jī)物，根據(jù)亞鐵氧化速率判斷不同濃度有機(jī)物對(duì)A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化的效果，為進(jìn)一步探究A.ferrooxidans BYM磁小體的發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。
研究表明，不同濃度的檸檬酸可能影響A.ferrooxidans磁小體相關(guān)基因mpsA、feoB、tonB及mpsA的表達(dá)，推測(cè)其原因可能是由于檸檬酸能夠螯合Fe3+，促進(jìn)A.ferrooxidans對(duì)Fe3+的轉(zhuǎn)運(yùn)[29]。對(duì)A.ferrooxidans R2進(jìn)行低分子量有機(jī)酸耐受試驗(yàn)，結(jié)果表明A.ferrooxidans R2可以耐受40 mmol/L的檸檬酸[30]。因此，本研究選擇檸檬酸探究其對(duì)A.ferrooxidans BYM菌體生長(zhǎng)的影響。酒石酸作為常見(jiàn)的金屬螯合劑常用于重金屬吸附，能夠較好地吸附被污染土壤中的鎳、銅、鋅、鎘和鉛[31]。0.5 mmol/L抗壞血酸能夠完全抑制A.ferrooxidans NCIM 5370中的過(guò)氧化氫酶活性[32]。其還原作用能夠減少Fe3+的積累，加速鐵的循環(huán)。因此推測(cè)，試驗(yàn)中添加l-抗壞血酸能夠通過(guò)還原作用消耗A.ferrooxidans BYM代謝產(chǎn)生的Fe3+，同時(shí)減少活性氧和自由基對(duì)A.ferrooxidans BYM的損傷。蘋(píng)果酸作為一種小分子量有機(jī)酸常用于金屬生物浸出[33]。因此，本研究添加蘋(píng)果酸，判斷其對(duì)A.ferrooxidansBYM菌體生長(zhǎng)的影響。在培養(yǎng)基中添加l-甘氨酸能夠促進(jìn)A.ferrooxidans CK浸出膠磷礦的效率，通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果可知，l-甘氨酸的存在能夠顯著增強(qiáng)細(xì)菌在礦物表面的吸附作用[34]。葡萄糖酸作為鐵螯合劑能夠在一定程度上促進(jìn)A.ferrooxidans ATCC 23270生長(zhǎng)[35]。因此，本研究通過(guò)添加葡萄糖酸驗(yàn)證其對(duì)亞鐵氧化的作用。10 mmol/L的吐溫-80能夠促進(jìn)A.ferrooxidans ATCC 23270生長(zhǎng)以及S0和CuFeS2的代謝，其能夠改變A.ferrooxidans細(xì)胞表面多聚物[36]。Jafari等報(bào)道，10 mmol/L SDS會(huì)影響A.ferrooxidansATCC 23270生長(zhǎng)，引起細(xì)胞膜損傷和礦物表面親水性變化，抑制A.ferrooxidans亞鐵氧化，降低銅浸出率[37]。由于SDS對(duì)A.ferrooxidans的強(qiáng)抑制作用，即使將SDS濃度降低至0.001 mmol/L，其仍能夠抑制A.ferrooxidans BYM生長(zhǎng)。在搖瓶試驗(yàn)中，通過(guò)添加30 mmol/L TritonX-100在A.ferrooxidans XZ11浸取黃銅礦的體系中，培養(yǎng)24 d，結(jié)果表明銅的生物浸出率相較于未添加有機(jī)物組提升了42.21%[38]。0.04 mmol/L EDTA處理A.ferrooxidans 1 h后，能夠去除表面脂多糖，對(duì)細(xì)胞形態(tài)和活性均未產(chǎn)生影響[39]。
結(jié)果表明(圖4)，有機(jī)酸中l(wèi)-抗壞血酸和蘋(píng)果酸對(duì)A.ferrooxidans BYM生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。抗壞血酸作為微量元素可以參與生物體的代謝過(guò)程，作為小分子抗氧化劑可以中和細(xì)胞代謝產(chǎn)生的活性氧和自由基對(duì)機(jī)體造成的損傷[40]。抗壞血酸作為輔酶因子為羥化酶和單加氧酶等15種哺乳動(dòng)物內(nèi)酶提供電子，參與了肉堿、膠原蛋白和神經(jīng)遞質(zhì)合成等過(guò)程[41]。因此，可推測(cè)試驗(yàn)中添加l-抗壞血酸能夠通過(guò)還原作用消耗A.ferrooxidansBYM代謝產(chǎn)生的Fe3+。檸檬酸的添加不能促進(jìn)A.ferrooxidans BYM生長(zhǎng)。蘋(píng)果酸作為三羧酸循環(huán)中的一環(huán)，其在某種程度上促進(jìn)了菌體的代謝，從而對(duì)亞鐵氧化產(chǎn)生了促進(jìn)作用。本研究通過(guò)添加0?30 mmol/L蘋(píng)果酸，明確了5 mmol/L的蘋(píng)果酸能夠促進(jìn)A.ferrooxidans BYM生長(zhǎng)。葡萄糖酸能夠螯合培養(yǎng)基中的鐵離子，從而促進(jìn)A.ferrooxidans BYM的亞鐵氧化速率。吐溫-80、TritonX-100以及SDS對(duì)A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化均起到了抑制作用，這可能是由于以上3種表面活性劑改變了A.ferrooxidans BYM細(xì)胞表面張力，抑制了A.ferrooxidans BYM生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致亞鐵氧化速率降低。本研究選擇EDTA-2Na的原因是其相較于EDTA在酸性條件下更容易溶解，因此選擇EDTA-2Na作為外源有機(jī)物進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果分析表明，EDTA-2Na不能促進(jìn)A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化，并且隨著EDTA-2Na濃度升高，可能會(huì)螯合培養(yǎng)基中的鐵離子，抑制A.ferrooxidansBYM生長(zhǎng)。
向M.magneticum AMB-1培養(yǎng)體系中添加EDTA、羅丹明B、抗壞血酸、赤蘚紅、鄰氨基苯甲酸、檸檬酸、3-(N-嗎啉)丙磺酸、3-(環(huán)己胺)-1-丙磺酸、鈣黃素、葡聚糖、阿侖膦酸、奈立膦酸和煙酰胺等鐵螯合劑可以促進(jìn)菌株生長(zhǎng)并提高磁小體產(chǎn)量；我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)，葡萄糖酸可以有效促進(jìn)A.ferrooxidans的生長(zhǎng)并促進(jìn)菌體合成磁小體[42]。一些有機(jī)物可以使細(xì)菌的表面變得更為光滑，并使菌體表面的官能團(tuán)變化[43]。這與本研究SEM及FTIR獲得的經(jīng)葡萄糖酸處理后A.ferrooxidans BYM表面變得光滑(圖6A、6B)、表面官能團(tuán)發(fā)生變化的結(jié)果一致(圖7)。對(duì)于趨磁的磁小體合成細(xì)菌M.magneticum AMB-1而言，有機(jī)物可以通過(guò)增加磁小體鏈的長(zhǎng)度來(lái)提高其單個(gè)細(xì)胞的磁小體數(shù)量[42]，盡管非趨磁性的A.ferrooxidans BYM不存在磁小體鏈，但葡萄糖酸作用后菌體內(nèi)的磁小體數(shù)量仍然增加，原因可能是葡萄糖酸促進(jìn)了菌體對(duì)鐵的吸收，具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。
微生物發(fā)酵動(dòng)力學(xué)能夠探究A.ferrooxidans BYM在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的菌體變化、磁小體生成和亞鐵消耗情況，此過(guò)程為磁小體的規(guī)模化發(fā)酵提供理論和實(shí)踐依據(jù)。發(fā)酵動(dòng)力學(xué)作為描述發(fā)酵過(guò)程微生物生長(zhǎng)、產(chǎn)物生成和底物消耗的學(xué)科，能夠在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)模型建立實(shí)現(xiàn)發(fā)酵的動(dòng)態(tài)監(jiān)控，以達(dá)到高效生產(chǎn)。目前，發(fā)酵動(dòng)力學(xué)主要分為菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)和底物消耗動(dòng)力學(xué)。Logistic方程作為經(jīng)典菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型，廣泛用于微生物的發(fā)酵研究，Logistic方程描述了三孢布拉霉發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素過(guò)程中菌體生長(zhǎng)情況，并很好地描述了菌體生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)情況[44]。Logistic方程對(duì)于嗜酸乳桿菌的菌體發(fā)酵進(jìn)行描述，并對(duì)其在48 h內(nèi)菌體生長(zhǎng)進(jìn)行分析[21]。對(duì)拉曼HLY0902進(jìn)行搖瓶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究，利用Logistic方程建立了菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型[20]。產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)是描述產(chǎn)物生成與菌體生長(zhǎng)之間的關(guān)系的科學(xué)，通過(guò)對(duì)產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)的探究，可以明確單一發(fā)酵和復(fù)合發(fā)酵的不同機(jī)制。底物消耗動(dòng)力學(xué)一般與細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)物生成和維持底物消耗的能量3種因素相關(guān)。通過(guò)描述發(fā)酵動(dòng)力學(xué)，能夠?qū)w生長(zhǎng)、目標(biāo)產(chǎn)物生成、底物消耗過(guò)程等階段進(jìn)行明確調(diào)控，這對(duì)于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)具有關(guān)鍵性意義。
本文以A.ferrooxidans BYM為目的菌株，探究在10 mmol/L葡萄糖酸下4 L發(fā)酵體系代謝變化。通過(guò)分批培養(yǎng)測(cè)定A.ferrooxidans BYM的生物量、磁小體生成量和亞鐵氧化速率，明確A.ferrooxidans BYM在各個(gè)階段的變化情況。基于經(jīng)典Logistic方程、Luedeking-Priet方程以及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型成功構(gòu)建了A.ferrooxidans BYM菌體生長(zhǎng)、磁小體合成及亞鐵消耗動(dòng)力學(xué)模型，其擬合度R2分別為0.99、0.98及0.98，數(shù)值均大于0.90，說(shuō)明模型能夠很好地反映A.ferrooxidans BYM發(fā)酵動(dòng)力學(xué)。通過(guò)非線性擬合的方法擬合得到的3個(gè)方程與實(shí)際值接近，誤差較小，能夠很好地反映A.ferrooxidans BYM在各個(gè)階段發(fā)酵變化。3個(gè)發(fā)酵模型的建立為今后的發(fā)酵條件控制和磁小體規(guī)模化發(fā)酵提供了一定的理論參考價(jià)值。
4、結(jié)論
本研究以A.ferrooxidans BYM為研究對(duì)象，通過(guò)單因素試驗(yàn)探究10種外源添加有機(jī)物對(duì)其生長(zhǎng)的影響，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果篩選得到對(duì)磁小體合成促進(jìn)效果最明顯的一種有機(jī)物。在最優(yōu)促進(jìn)劑下對(duì)A.ferrooxidans BYM在發(fā)酵過(guò)程中的菌體生長(zhǎng)、磁小體合成以及亞鐵消耗動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。通過(guò)以上探究過(guò)程，本研究得出以下結(jié)論：
(1)通過(guò)亞鐵氧化速率的測(cè)定，篩選出l-抗壞血酸、蘋(píng)果酸以及葡萄糖酸對(duì)A.ferrooxidans BYM生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用，并確定了合適的濃度范圍。
(2)通過(guò)4 L體系發(fā)酵試驗(yàn)，對(duì)3種有機(jī)物進(jìn)行濃度優(yōu)化。獲得最優(yōu)促進(jìn)劑葡萄糖酸，以10 mmol/L添加時(shí)，磁小體產(chǎn)量可達(dá)2.00×10?3 g/L。
(3)通過(guò)不同時(shí)間梯度的分批發(fā)酵試驗(yàn)，本研究建立了A.ferrooxidans BYM的菌體生長(zhǎng)、磁小體生成和亞鐵消耗動(dòng)力學(xué)模型。
研究結(jié)果表明在葡萄糖酸的作用下能夠?qū).ferrooxidans BYM發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行調(diào)控，改善磁小體發(fā)酵過(guò)程，為后續(xù)大體系通過(guò)微生物發(fā)酵產(chǎn)磁小體提供理論及實(shí)踐依據(jù)。
10種有機(jī)物對(duì)氧化亞鐵硫桿菌BYM磁小體生長(zhǎng)、合成、發(fā)酵、產(chǎn)量的影響（一）
10種有機(jī)物對(duì)氧化亞鐵硫桿菌BYM磁小體生長(zhǎng)、合成、發(fā)酵、產(chǎn)量的影響（二）
10種有機(jī)物對(duì)氧化亞鐵硫桿菌BYM磁小體生長(zhǎng)、合成、發(fā)酵、產(chǎn)量的影響（三）
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