RIP 衍生物對?耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生長曲線及生物膜形成的影響（二）
2.3 不同時相RIP1183 對RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA基因表達(dá)水平的影響
遲緩期（2 h），兩組RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 總體表達(dá)水平都較低；對數(shù)期（6 h），RNAⅢ和HLA 表達(dá)水平快速升高；穩(wěn)定期（10 h），RNAⅢ和HLA 表達(dá)水平下降，但是生物膜形成的黏附相關(guān)基因（icaA 和fnbA）的表達(dá)水平升高。
遲緩期（2 h），與對照組比較，RIP 組RNAⅢ表達(dá)明顯降低（P ＜0.05）。對數(shù)期（6 h），與對照組比較，RIP 組RNAⅢ、HLA 表達(dá)顯著降低（P ＜0.01）；穩(wěn)定期（10 h），與對照組比較，RIP 組icaA、fnbA 和RNAⅢ表達(dá)顯著降低（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表2。
圖2 RIP1183 對細(xì)菌生物膜形成的影響
表2 不同時相RIP1183 對RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 基因表達(dá)水平的影響（，n=6）
注：與對照組同期比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；HLA：人類白細(xì)胞抗原；RIP：RNAⅢ抑制肽
3 討論
agr 群體感應(yīng)系統(tǒng)是金黃色葡萄球菌的重要調(diào)控系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)細(xì)菌多種生理活動，對于維持金黃色葡萄球菌生物膜結(jié)構(gòu)和細(xì)菌的致病性也是必不可少的[9-10]。RNAⅢ是agr 系統(tǒng)的效應(yīng)分子，agr 系統(tǒng)激活后，RNAⅢ表達(dá)水平升高，RNAⅢ通過與靶基因5’非翻譯區(qū)（5’UTR）反義堿基配對，形成RNA 雙鏈體，從而進(jìn)一步調(diào)控一系列靶基因的表達(dá)。RNAⅢ調(diào)控多種毒力因子表達(dá)包括葡萄球菌溶素和細(xì)菌生物膜形成相關(guān)蛋白的表達(dá)。
其中最重要的1 種葡萄球菌溶素是α-溶血素，由HLA 基因編碼，它可以破壞宿主多種細(xì)胞的細(xì)胞膜，改變細(xì)胞滲透壓，使宿主細(xì)胞溶解。動物實驗表明，敲除金黃色葡萄球菌HLA基因后，顯著降低了其對感染動物的致病性。纖連蛋白結(jié)合蛋白FnbA 是由fnbA 基因編碼的1 種多閾結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，它能夠吸引并黏附宿主的纖維蛋白原，介導(dǎo)金黃色葡萄球菌黏附于生物體表面，并使細(xì)菌逃離免疫系統(tǒng)的識別，是生物膜形成的黏附階段的重要調(diào)控蛋白。icaA 基因編碼的蛋白是1 種普遍存在于金黃色葡萄球菌中的跨膜蛋白，具有N-乙酰葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶活性，與細(xì)菌生物膜的形成有直接關(guān)系，也是生物膜形成的必要因素。
在培養(yǎng)基中補充葡萄糖，可以促進(jìn)細(xì)菌生物膜的形成，因此本研究采用含有葡萄糖的TSB 培養(yǎng)基培養(yǎng)MRSA（USA300），發(fā)現(xiàn)RIP1183 不影響MRSA（USA300）的生長，結(jié)果與文獻(xiàn)報道的群體抑制劑不影響細(xì)菌生長的結(jié)論相一致。但是體外生物膜形成實驗結(jié)果顯示，RIP1183 可以顯著抑制MRSA（USA300）生物膜的形成。為了探討金黃色葡萄球菌不同生長時相agr 系統(tǒng)的激活情況，以及RIP1183對葡萄球菌溶素和生物膜形成的影響，分別在細(xì)菌遲緩期（2 h）、對數(shù)期（6 h）和穩(wěn)定期（10 h），檢測了RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 基因的轉(zhuǎn)錄水平。
結(jié)果顯示，遲緩期（2 h）是細(xì)菌轉(zhuǎn)接后對新環(huán)境的短暫適應(yīng)過程，4 種基因RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 總體表達(dá)水平都較低；進(jìn)入對數(shù)期（6 h）后，細(xì)菌快速增殖，RNAⅢ表達(dá)水平快速升高，顯示agr 系統(tǒng)被激活，HLA表達(dá)也快速增高；進(jìn)入穩(wěn)定期（10 h）后，HLA 表達(dá)下降，但是與生物膜形成的黏附相關(guān)基因（icaA 和fnbA）的表達(dá)水平升高。MRSA 通過agr 群體感應(yīng)系統(tǒng)，在不同時相調(diào)控不同的毒力因子的表達(dá)，以適應(yīng)不同生長環(huán)境。對數(shù)期，釋放大量葡萄球菌溶素，增加細(xì)菌的毒力和致病性；到了穩(wěn)定期，黏附相關(guān)蛋白表達(dá)水平增高，促進(jìn)細(xì)菌生物膜的形成，有利于細(xì)菌對抗外界極端環(huán)境（如營養(yǎng)缺乏、低pH、高滲透壓或抗生素等），這是細(xì)菌非常重要的環(huán)境適應(yīng)機制。
更重要的是，在3 個時相，RIP1183 均能顯著抑制RNAⅢ表達(dá)，同時顯著降低對數(shù)期HLA 的表達(dá)及穩(wěn)定期生物膜黏附相關(guān)基因（icaA 和fnbA）的表達(dá)水平。本研究結(jié)果提示，群體抑制劑RIP1183 能通過干擾細(xì)菌agr 系統(tǒng)，影響不同時相，不同基因的表達(dá)，從而破壞細(xì)菌對環(huán)境適應(yīng)機制，可能是其抗MRSA 活性的重要機制之一。另外，群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制劑不影響細(xì)菌的生長，不會或幾乎不會給細(xì)菌造成選擇性生存壓力，引起細(xì)菌耐藥的可能性比較小[22]。因此，抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)可能成為治療MRSA 生物膜相關(guān)感染性疾病的新策略。
RIP 衍生物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生長曲線及生物膜形成的影響（一）
RIP 衍生物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生長曲線及生物膜形成的影響（二）
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