拮抗菌生長曲線測定、鑒定及對煙草赤星病室內(nèi)防治效果（一）
由鏈格孢菌（Alternaria alternata）引起的煙草赤星病主要危害成熟期的烤煙上部葉，發(fā)病嚴重地塊幾乎絕收，嚴重影響煙葉產(chǎn)質(zhì)量。目前化學防治依然是防治煙草赤星病的主要措施，然而長期使用化學藥劑易造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留和危害人畜健康等問題，且近年來有研究報道鏈格孢菌對96%（質(zhì)量分數(shù)）苯醚甲環(huán)唑和97%（質(zhì)量分數(shù)）氟環(huán)唑及93%（質(zhì)量分數(shù)）菌核凈等藥劑已產(chǎn)生抗藥性。而生物防治具有無毒、無殘留和對環(huán)境友好等優(yōu)點，成為植物病害防治研究的熱點之一。
目前，植物病害生物防治中應用最廣泛的為芽胞桿菌屬細菌，因其有抗菌譜廣、耐鹽性強、能產(chǎn)生多種拮抗作用酶、繁殖快、抗逆性強和生物安全性高等優(yōu)點，具有較高應用價值。宋莉莎等從貴州省甕安縣煙區(qū)土壤中篩選具有拮抗作用的細菌發(fā)現(xiàn)，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌（Bacillus methylotrophicus）對鏈格孢菌有較強的抑制作用，其無菌發(fā)酵液對該病菌抑菌帶可達23.5 mm。從福建、山東和云南等地煙草葉片中分離得到187株菌株，發(fā)現(xiàn)萎縮芽胞桿菌（Bacillus atrophaeus）與貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）分泌的脂肽類物質(zhì)對鏈格孢菌菌絲生長也有明顯抑制作用，抑制率分別為56.9%和65.0%。
前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，貴州省清鎮(zhèn)市衛(wèi)城鎮(zhèn)煙區(qū)煙草赤星病發(fā)生嚴重，部分地塊發(fā)病率高達100%，幾乎絕收，給當?shù)責熮r(nóng)造成巨大經(jīng)濟損失。為篩選對該地區(qū)煙草赤星病具有拮抗作用的菌株，采用5點取樣法，從貴州省清鎮(zhèn)市衛(wèi)城鎮(zhèn)煙草赤星病發(fā)生嚴重地塊采集健康煙株根際土壤，帶回實驗室進行芽胞桿菌分離純化，使用平板對峙法篩選對病原真菌具有較好拮抗作用的菌株，根據(jù)形態(tài)特征、生理生化指標及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對其進行鑒定，并通過盆栽試驗測定該拮抗菌L249對煙草赤星病防治效果，旨在為煙草赤星病的生物防治提供依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與試劑
供試土樣采集于貴州省清鎮(zhèn)市衛(wèi)城鎮(zhèn)煙草赤星病發(fā)生嚴重地塊健康烤煙根際，采用5點取樣法取樣后用無菌自封袋封存并編號。供試病原菌為鏈格孢菌（Alternaria alternata）、高粱葉點霉菌（Phyllosticta sorghina）、大斑突臍蠕孢菌（Exserohilum turcicum）、煙草炭疽菌（Colletotrichum nicotianae）和尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum），均由貴州大學煙草學院病理實驗室保存并提供。供試烤煙品種為K326，選用長53 mm、寬35 mm、高58 mm規(guī)格的育苗盆育苗，每盆1株，待烤煙幼苗生長至5片真葉時，移栽至底徑為140 mm、口徑180 mm、高160 mm花盆中繼續(xù)生長至8~10片葉備用。
供試藥劑為10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑（WDG）（先正達南通作物保護有限公司），供試試劑有1%（質(zhì)量分數(shù)）草酸銨結(jié)晶紫、明膠及9%（質(zhì)量分數(shù)）NaCl溶液等。
1.2方法
1.2.1土壤拮抗菌分離
采用稀釋涂布平板法，稱取10 g土樣放入含90 mL無菌水的錐形瓶中，置于37℃、200 r/min恒溫搖床振蕩20 min。85℃水浴處理10 min后梯度稀釋得到濃度為10-2、10-3、10-4和10-5的土壤懸浮液。取100μL稀釋液均勻涂布于LB平板，各濃度3個重復，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。待平板長出單菌落后，挑取形態(tài)不同的單菌落純化后編號，置于LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)24 h后，與30%（體積分數(shù)）甘油等比例混合后置于凍存管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?
1.2.2拮抗菌抑菌譜測定
將5種植物病原真菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，分別取直徑為6 mm的菌餅接種到PDA平板中央（培養(yǎng)皿直徑為85 mm），距中央2.5 cm處再接種5μL拮抗菌菌液，以只接種病原菌的PDA平板為對照，每種病原菌接種4個培養(yǎng)皿，重復3次（下同）。待對照長滿培養(yǎng)皿后，測量抑菌帶寬度并挑取鏈格孢菌邊緣菌絲，置于Axio Imager M2蔡司金相顯微鏡（德國Carl Zeiss Microscopy GmbH公司）下觀察菌絲形態(tài)。采用十字交叉法測量菌落直徑，并計算菌絲生長抑制率。
生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）*100%
1.2.3拮抗菌生長曲線測定
將保存的拮抗菌活化后挑取單菌落接種到裝有5 mL LB培養(yǎng)液的試管中，置于37℃、200 r/min條件下的搖床中培養(yǎng)12 h后，獲得種子液。使用移液槍吸取1 mL種子液接種于100 mL的LB培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，采用比濁法，每隔30 min用分光光度計在600 nm波長處測定菌液的吸光度值（OD），直至OD值緩慢下降時停止測量。
1.2.4生物膜測定
將活化的芽胞桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600約為1.0時，4℃離心收集菌體，用無菌水洗滌后重懸于等體積的MSgg培養(yǎng)基中。取5 mL MSgg培養(yǎng)基加入12孔細胞培養(yǎng)板中，然后分別滴加10μL菌懸液，于37℃靜置培養(yǎng)24 h后觀察成膜情況。
1.2.5拮抗菌生防相關(guān)酶類測定
將篩選出具有良好拮抗作用的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃、200 r/min的搖床中過夜培養(yǎng)后，滴加5μL菌液至蛋白酶檢測培養(yǎng)基和纖維素酶檢測培養(yǎng)基中央，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察菌落周圍是否產(chǎn)生消解圈。
1.2.6拮抗菌鑒定
結(jié)合形態(tài)特征、生理生化指標及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析方法對篩選的拮抗菌進行鑒定。
（1）菌落形態(tài)觀察：將活化后的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取5μL菌液接種于LB平板中央并置于37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，24 h后觀察菌落形態(tài)特征。
（2）生理生化指標：參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊》，對拮抗細菌進行革蘭氏染色、酶的水解、明膠的液化、檸檬酸鈉鹽的利用、吲哚試驗、V-P試驗、甲基紅試驗及耐鹽試驗等多項生理生化特征分析。
（3）16S rDNA、gyrA序列擴增及系統(tǒng)發(fā)育分析：使用BioTeke細菌基因組DNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司），提取拮抗菌株DNA。利用細菌通用引物16S rDNA及gyrA對提取的細菌DNA進行PCR擴增后，采用1.0%（質(zhì)量分數(shù)）瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程（北京）股份有限公司測序。測序結(jié)果修正后經(jīng)NCBI進行BLAST初步比對，根據(jù)比對結(jié)果下載親緣關(guān)系較近的序列及模式菌株（表1），在BioEdit 7.0軟件上對各菌株的序列進行修正后，以黃熱厭氧芽胞桿菌（Anoxybacillus flavithermus）為外群，使用MEGA 5.0軟件并采用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹。
表1用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的菌株號及GenBank登錄號①
1.2.7拮抗菌防治煙草赤星病盆栽試驗
待烤煙生長至8~10片葉時進行處理，采用噴霧法將濃度為1×108 cfu/mL的拮抗菌發(fā)酵液均勻噴施在煙草葉片正面，以液滴不滴落為標準，晾干后在葉片上接種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d、直徑為6 mm的鏈格孢菌菌餅，每片煙葉接種4個菌餅。試驗設4個處理：以噴施無菌水的煙株為CK1；噴施無菌水晾干后接種病原菌的煙株為CK2；噴施發(fā)酵液晾干后接種病原菌的煙株為處理3；噴施2 000倍液10%苯醚甲環(huán)唑WDG晾干后接種病原菌的煙株為處理4。每處理3個重復，每個重復10株煙苗。置于光照和黑暗各12 h、溫度為28℃、相對濕度為90%以上的溫室中培養(yǎng)，直至CK2出現(xiàn)明顯病斑時，根據(jù)赤星病病害分級標準進行病害調(diào)查（以葉片為單位），并計算發(fā)病率、病情指數(shù)和相對防效。
計算公式：
1.3數(shù)據(jù)分析
使用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，運用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)Duncan’s新復極差法對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗。
拮抗菌生長曲線測定、鑒定及對煙草赤星病室內(nèi)防治效果（一）
拮抗菌生長曲線測定、鑒定及對煙草赤星病室內(nèi)防治效果（二）
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