?食源性致病菌：微生物群體延滯期特點(diǎn)與測(cè)定方法
生長(zhǎng)曲線群體生長(zhǎng)延滯期的測(cè)定
目前微生物延滯期仍未基于微生物生長(zhǎng)機(jī)理明確定義，生物學(xué)上被普遍接受的定義是：微生物群體經(jīng)歷環(huán)境突變，自我調(diào)整后開(kāi)始繁殖的時(shí)間。幾何意義上微生物延滯期是指微生物對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期達(dá)到最大比生長(zhǎng)速率時(shí)，生長(zhǎng)曲線切線的反向延長(zhǎng)線和初始菌量水平延長(zhǎng)線的交點(diǎn)在時(shí)間軸上的投影點(diǎn)與零時(shí)刻的時(shí)間間隔。
基于微生物生長(zhǎng)延滯期的測(cè)定方法，微生物群體延滯期需通過(guò)生長(zhǎng)模型擬合生長(zhǎng)曲線間接獲取。
微生物培養(yǎng)在延滯期有以下特點(diǎn)：
（1）細(xì)胞物質(zhì)開(kāi)始增加；
（2）有的細(xì)胞因不適應(yīng)環(huán)境而死亡；
（3）微生物細(xì)胞總數(shù)有所下降；
（4）延滯期末期，細(xì)胞代謝活動(dòng)能力開(kāi)始增強(qiáng)，并開(kāi)始細(xì)胞分裂。
目前測(cè)定微生物生長(zhǎng)曲線的方法主要分為傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)方法。表1中總結(jié)了應(yīng)用傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)方法測(cè)定微生物生長(zhǎng)曲線進(jìn)而通過(guò)模型擬合獲取生長(zhǎng)延滯期的相關(guān)研究。傳統(tǒng)測(cè)定微生物生長(zhǎng)曲線的方法是活菌計(jì)數(shù)法，因其不受菌懸液顏色及濁度的影響而成為測(cè)定食品中食源性致病菌的主流手段。但是該方法操作繁瑣、耗時(shí)耗力，且應(yīng)用該方法獲取的生長(zhǎng)參數(shù)準(zhǔn)確性與數(shù)據(jù)點(diǎn)的數(shù)量及觀測(cè)點(diǎn)的位置均相關(guān)，因此活菌計(jì)數(shù)法還需進(jìn)一步改進(jìn)。相較于活菌計(jì)數(shù)法，比濁法因其操作簡(jiǎn)便、省時(shí)省力的優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于微生物生長(zhǎng)曲線的測(cè)定和建模研究中。然而，比濁法的檢測(cè)限僅能達(dá)到106～107CFU/mL，且只可用于液體培養(yǎng)基的測(cè)定，同時(shí)因測(cè)定的菌懸液濃度并不是活菌濃度而導(dǎo)致獲得的生長(zhǎng)參數(shù)有些許誤差。建議今后的研究可基于技術(shù)層面對(duì)該方法進(jìn)行優(yōu)化，使其能更好地描述低濃度食源性致病菌的生長(zhǎng)，為進(jìn)一步研究微生物生長(zhǎng)提供依據(jù)。
表1應(yīng)用各種方法測(cè)定食源性致病菌生長(zhǎng)曲線的相關(guān)研究
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)和PCR等分子生物學(xué)技術(shù)也被應(yīng)用于微生物生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，相較于傳統(tǒng)方法，這些分子生物學(xué)技術(shù)具有省時(shí)省力、高效等優(yōu)點(diǎn)，且可同時(shí)測(cè)定兩種細(xì)菌的生長(zhǎng)，極大地改善了傳統(tǒng)方法的不足。應(yīng)用DGGE結(jié)合PCR技術(shù)測(cè)定了單增李斯特菌和副溶血性弧菌的生長(zhǎng)情況，進(jìn)而通過(guò)Baranyi模型擬合其生長(zhǎng)曲線獲取延滯期。傳統(tǒng)PCR技術(shù)需結(jié)合DGGE技術(shù)才可定量測(cè)定微生物的生長(zhǎng)情況，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）技術(shù)的出現(xiàn)彌補(bǔ)了其缺陷，實(shí)現(xiàn)了從定性到定量的突破。將金黃色葡萄球菌的菌液接種于豬肉中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間提取生長(zhǎng)后細(xì)菌的總基因組DNA，并對(duì)其進(jìn)行qPCR分析，進(jìn)而根據(jù)已建立的微生物濃度與qPCR的循環(huán)閾（cycle threshold，Ct）值間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量描述豬肉中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)情況，最后應(yīng)用模型擬合其生長(zhǎng)曲線，間接獲取生長(zhǎng)延滯期。同樣應(yīng)用qPCR技術(shù)分別定量描述了豬肉中單增李斯特菌和即食南美白對(duì)蝦中副溶血性弧菌的生長(zhǎng)情況，并對(duì)其進(jìn)行模型擬合，獲取了延滯期。但因qPCR技術(shù)無(wú)法區(qū)分活菌和死菌，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的誤差。基于此，將疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）與多重qPCR技術(shù)相結(jié)合，極好地定量描述了生鮮南美白對(duì)蝦樣品中副溶血性弧菌和單增李斯特菌的生長(zhǎng)行為。雖然PMA的應(yīng)用可區(qū)分活死菌，但其會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生一定的損傷。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為預(yù)測(cè)微生物學(xué)注入了新的活力，加速了預(yù)測(cè)微生物學(xué)的發(fā)展。然而，任何方法均需辯證地看待，即每一種方法均各有優(yōu)點(diǎn)和局限性，因此分子生物學(xué)技術(shù)并不能完全取代傳統(tǒng)方法，仍需根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的實(shí)驗(yàn)方法。
綜上所述，雖然微生物群體延滯期和單細(xì)胞延滯期均可采用上述方法間接獲得，但是微生物群體延滯期會(huì)因擬合模型不同而不同，同時(shí)微生物單細(xì)胞生長(zhǎng)觀測(cè)方法依然存在精度低、控制難、耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題。
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