臨床結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)：分子DST檢測(cè)VS表型DST藥敏診斷技術(shù)（二）
2結(jié)果
2.1分子DST檢測(cè)與表型DST藥敏檢測(cè)結(jié)果分析
2.1.1兩種檢測(cè)方法耐藥性檢測(cè)結(jié)果一致率1750例標(biāo)本按流程操作共檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌菌株1596例，陽(yáng)性率為91.20%，非結(jié)核分枝桿菌（NTM）154例（8.80%）。其中快速分子DST檢測(cè)出利福平（RFP）耐藥菌株98例，耐藥率為6.14%（98/1596），表型DST藥敏檢測(cè)出利福平（RFP）耐藥菌株88例，耐藥率為5.51%（88/1596）;兩種方法均檢出利福平（RFP）敏感1478例，均耐藥64例，共1542例利福平（RFP）檢測(cè)結(jié)果一致，一致率為96.62%。快速分子DST檢測(cè)出異煙肼（INH）耐藥95例，耐藥率為5.95%（95/1596），表型DST藥敏檢測(cè)出異煙肼（INH）91例，耐藥率為5.70%（91/1596），兩種方法異煙肼（INH）均敏感1465例，均耐藥55例，共1520例異煙肼（INH）分子DST檢測(cè)與表型DST藥敏檢測(cè)結(jié)果一致，一致率為95.24%。見(jiàn)表1。兩種方法共檢測(cè)出耐多藥肺結(jié)核（MDR-TB）患者34例，耐多藥率為2.13%（34/1596）。
2.1.2分子檢測(cè)與表型藥敏對(duì)利福平檢測(cè)結(jié)果分析54例患者利福平（RFP）分子DST檢測(cè)與表型DST藥敏結(jié)果不同，分子DST檢測(cè)利福平（RFP）耐藥而表型DST敏感32例;分子DST檢測(cè)利福平（RFP）敏感而表型DST耐藥22例，不一致率為3.38%;利福平分子檢測(cè)結(jié)果敏感度為97.88%，特異度為74.42%。見(jiàn)表2。
2.1.3分子檢測(cè)與表型藥敏對(duì)異煙肼檢測(cè)結(jié)果分析76例患者異煙肼（INH）分子DST檢測(cè)與表型DST藥敏結(jié)果不同，分子DST檢測(cè)異煙肼（INH）耐藥而表型DST敏感40例，分子DST檢測(cè)敏感而表型DST耐藥36例，不一致率為4.76%。分子檢測(cè)對(duì)異煙肼檢測(cè)結(jié)果敏感度為97.34%，特異度為60.44%。見(jiàn)表3。
2.2分子檢測(cè)基因突變位點(diǎn)與表型藥敏檢測(cè)結(jié)果分析
利福平（RFP）耐藥檢測(cè)中，快速分子DST檢測(cè)ropB基因突變檢出率為94.79%（91/96），表型DST藥敏利福平耐藥檢出率為93.02%（80/86），其中位點(diǎn)531（C-T）、513（C-A）、516（A-T）、516（G-T）突變位點(diǎn)的檢出一致率高（96.56%～100.00%）;而526（A-G）、511（T-C）位點(diǎn)分子檢測(cè)出陽(yáng)性，表型DST藥敏檢測(cè)未顯示;533（T-C）、531（C-G）、526（A-T）位點(diǎn)的一致符合率為50.00%、77.78%、66.67%;利福平（RFP）突變位點(diǎn)分子與表型DST藥敏一致率為87.91%（80/91）。
異煙肼（INH）檢測(cè)中，快速分子DST檢測(cè)katG、inhA基因突變位點(diǎn)的檢出率為95.79%（91/95）;表型藥敏DST異煙肼耐藥檢出率為87.91%（80/91）;其中katG315（G-C）、inhA15（C-T）位點(diǎn)的一致率較高，分別為88.73%、88.24%，但仍然發(fā)現(xiàn)尚有10例不一致;katG 315（G-A）有1例分子與表型DST藥敏結(jié)果不一致。見(jiàn)表4。初始分子檢測(cè)與表型藥敏結(jié)果不一致分析思路見(jiàn)圖2。
3討論
2020年全球結(jié)核病報(bào)告顯示，2019年，全球有近50萬(wàn)人罹患利福平耐藥（RR-TB）結(jié)核病，其中78%患有耐多藥（MDR-TB）。隨著分子診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用，2019年發(fā)現(xiàn)并登記MDR/RR-TB患者較2018年增加了10%，但其治療成功率僅為57%。因此，提高細(xì)菌學(xué)確診的結(jié)核病患者比例，擴(kuò)大細(xì)菌學(xué)確診的結(jié)核病患者耐藥檢測(cè)比例，提高治愈率，是遏制耐藥結(jié)核病傳播的重要措施。
Xpert MTB/RIF檢測(cè)系統(tǒng)是以實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，ropB基因?yàn)榘谢颍瑱z測(cè)周期僅2 h，是目前WHO推薦的RFP耐藥的檢測(cè)方法。本研究結(jié)果顯示，快速分子檢測(cè)ropB基因突變檢出率為94.79%（91/96），與李妍等研究痰標(biāo)本中Xpert MTB/RIF敏感度高達(dá)97.5%、特異度為95%～99%相一致。
基因芯片技術(shù)是將MTB的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在芯片上的探針雜交、掃描芯片及判讀結(jié)果，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床耐藥性的檢測(cè)及基因組的比較分析。楊映暉等研究顯示，基因芯片檢測(cè)MDR-TB的敏感度與特異度分別為64.62%和97.75%。本研究結(jié)果顯示，異煙肼（INH）快速分子檢測(cè)中，katG、inhA基因突變位點(diǎn)的檢出率為95.79%（91/95），與相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)果一致。
本研究通過(guò)對(duì)2017年1月至2020年12月確診的1750例涂陽(yáng)肺結(jié)核患者呼吸道標(biāo)本中檢測(cè)到的1596例結(jié)核分枝桿菌菌株結(jié)果進(jìn)行分析，快速分子DST檢測(cè)技術(shù)與表型DST藥敏檢測(cè)的利福平、異煙肼一致率分別達(dá)96.62%、95.24%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示在臨床上可通過(guò)擴(kuò)大分子檢測(cè)技術(shù)作為初始診斷工具，將所有肺結(jié)核患者的初次痰標(biāo)本、肺泡灌洗液等呼吸道標(biāo)本納入分子檢測(cè)初始診斷范圍，加大在基層醫(yī)院的推廣應(yīng)用，才能確保所有診斷為耐藥（MR-TB）、耐多藥（MDR/RR-TB）的患者早期納入治療，改變耐藥結(jié)核納入治療率低的現(xiàn)狀。2019年全球納入治療的患者比例僅占估算MDR/RR-TB患者數(shù)的38%。研究發(fā)現(xiàn)，嘉興市的耐多藥率僅為2.13%，低于浙江省耐多藥結(jié)核發(fā)病率，證實(shí)了嘉興市擴(kuò)大分子初始檢測(cè)策略遏制耐藥結(jié)核傳播的有效性。
本研究結(jié)果還顯示，雖是同一標(biāo)本平行檢測(cè)，也存在著分子檢測(cè)與表型藥敏檢測(cè)結(jié)果不一致的現(xiàn)象，尚有54例利福平（3.38%），76例異煙肼（4.76%）檢測(cè)結(jié)果不一致，給臨床個(gè)體治療方案的選擇帶來(lái)困惑，也是現(xiàn)階段耐藥結(jié)核治愈率低的因素之一。WHO報(bào)告顯示，2019年全球耐藥結(jié)核病治療成功率僅為57%。因此，需認(rèn)真查找分子DST檢測(cè)與表型DST藥敏檢測(cè)結(jié)果不一致的原因，及時(shí)分析，調(diào)整每一例耐藥結(jié)核患者的治療方案，盡早盡快實(shí)施個(gè)體化精準(zhǔn)診療策略，才能提升治愈率。
本研究涉及到的54例利福平，76例異煙肼患者，針對(duì)兩種檢測(cè)結(jié)果不一致的原因分析如下：
①檢測(cè)標(biāo)本是否一致。仔細(xì)查找發(fā)現(xiàn)2例患者分子檢測(cè)與表型培養(yǎng)的標(biāo)本不是同一個(gè)檢測(cè)標(biāo)本;1例患者標(biāo)本因條形碼掃碼差錯(cuò)而出現(xiàn)偏差，予重新留取痰標(biāo)本進(jìn)行平行檢測(cè)。
②檢測(cè)技術(shù)的局限性。Xpert MTB/RIF、基因芯片快速分子檢測(cè)可檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌的核酸，但無(wú)法區(qū)別活菌還是死菌;本研究發(fā)現(xiàn)其中1例分子檢測(cè)敏感，表型藥敏顯示耐藥，原因是操作過(guò)程中標(biāo)本處理不充分，氫氧化鈉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，消化過(guò)程中發(fā)生了結(jié)核分枝桿菌核酸（RNA）降解。1例肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性，表型培養(yǎng)陰性，查找原因發(fā)現(xiàn)支氣管鏡檢查消毒清洗不徹底有死菌殘留存在，而Xpert MTB/RIF檢測(cè)DNA敏感度高所致。另外，還需分析在檢測(cè)過(guò)程中是否存在分子檢測(cè)系統(tǒng)的故障、溫度的錯(cuò)誤、試劑盒儲(chǔ)存不合理等因素。表型固體培養(yǎng)存在絕對(duì)濃度法偏差較大、選取菌落時(shí)操作不當(dāng)?shù)纫蛩亍Ｒ后w960自動(dòng)培養(yǎng)時(shí)吡嗪酰胺（PZA）藥敏菌株過(guò)量，在代謝過(guò)程產(chǎn)生大量氨類(lèi)物質(zhì)，從而使整個(gè)液體培養(yǎng)環(huán)境的pH值升高，導(dǎo)致PZA失去殺菌能力而造成假陽(yáng)性結(jié)果。可能導(dǎo)致其藥敏試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差，造成PZA分子與表型藥敏結(jié)果不一致。
③不同突變類(lèi)型與耐藥相關(guān)性。從突變位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)1例快速分子檢測(cè)利福平（RFP）基因ropB位點(diǎn)526（A-G）突變、3例利福平（RFP）511（T-C）位點(diǎn)分子檢測(cè)陽(yáng)性，而表型藥敏檢測(cè)并不耐藥;1例利福平（RFP）基因533（T-C）、2例531（C-G）、1例526（A-T）位點(diǎn)突變不一致，提示基因突變位點(diǎn)不同，與表型藥敏試驗(yàn)的相關(guān)性也是不同的。郭晶等研究顯示，基因突變?cè)诓煌挲g組人群中存在一定的差異。個(gè)別突變位點(diǎn)還應(yīng)當(dāng)結(jié)合臨床治療情況進(jìn)行觀察與分析，不同突變位點(diǎn)應(yīng)當(dāng)結(jié)合患者的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與整體治療情況進(jìn)行個(gè)體化治療。
④靜默突變。沉默子突變只是改變核苷酸位點(diǎn)而不改變編碼蛋白質(zhì)性質(zhì)，此時(shí)Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)為利福平假陽(yáng)性，表型培養(yǎng)藥敏敏感;這些Xpert MTB/RIF檢測(cè)假陽(yáng)性患者給予一線抗結(jié)核藥物仍然有成功治愈的可能，臨床需謹(jǐn)慎甄別。
⑤異質(zhì)性耐藥。異質(zhì)性耐藥是指在臨床同一類(lèi)患者體內(nèi)分離出結(jié)核分枝桿菌樣本中同時(shí)存在敏感和耐藥菌株，敏感和耐藥菌株共同感染或敏感株部分亞群發(fā)生耐藥突變所致。當(dāng)存在異質(zhì)性耐藥的MTB中耐藥亞群比例高于分子檢測(cè)的敏感度時(shí)，臨床檢測(cè)出并判斷為耐藥;當(dāng)耐藥亞群比例低于分子檢測(cè)敏感度時(shí)，就會(huì)判讀為敏感，導(dǎo)致部分MTB的分子檢測(cè)與表型耐藥檢測(cè)結(jié)果不一致。本研究結(jié)果顯示，有22例快速分子檢測(cè)利福平（RFP）敏感，表型藥敏檢測(cè)耐藥，分子檢測(cè)假敏感可能與異質(zhì)性耐藥有關(guān)。分子檢測(cè)需達(dá)到≥20%以上的耐藥亞群時(shí)才能檢測(cè)出，而表型藥敏可檢測(cè)出1%的耐藥菌株。異質(zhì)性耐藥反映了MTB群體從部分耐藥向全體耐藥轉(zhuǎn)變的中間過(guò)程。
⑥基因突變以外的其他耐藥機(jī)制引起的MTB耐藥。另外2例異煙肼（INH）、利福平（RFP）分子檢測(cè)敏感但表型藥敏耐藥不一致的原因不明，可能存在藥物外排泵、MTB細(xì)胞壁增厚難以穿透、抗結(jié)核藥物失活等由基因突變以外的其他耐藥機(jī)制所致。
綜上所述，分子DST檢測(cè)及表型DST藥敏診斷技術(shù)的應(yīng)用，給“終結(jié)結(jié)核病策略”提供了診斷工具，給臨床耐藥結(jié)核病的治療帶來(lái)了診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”。建議在有條件的定點(diǎn)醫(yī)院結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室可使用兩種檢測(cè)方法平行檢測(cè)以提高精準(zhǔn)度;當(dāng)臨床檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)初始分子檢測(cè)與表型藥敏結(jié)果不一致時(shí)，應(yīng)認(rèn)真分析原因、及時(shí)調(diào)整治療方案、實(shí)施個(gè)體化精準(zhǔn)診療策略，提高耐藥結(jié)核患者的治愈率。
相關(guān)新聞推薦
1、發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒構(gòu)建燈盞花發(fā)根最優(yōu)的培養(yǎng)體系（二）
2、三種抗菌藥物處理后持留菌株和抗藥菌株生長(zhǎng)曲線、優(yōu)勢(shì)的比較——摘要、材料與方法
3、忍冬提取液對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞形態(tài)和生物膜形成能力的影響（四）