水貂李氏桿菌的分離鑒定、生化試驗(yàn)、藥敏實(shí)驗(yàn)、毒力試驗(yàn)——材料與方法
山東日照某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生神經(jīng)癥狀為主要特征的疾病，發(fā)病率較少，主要表現(xiàn)為食欲減退、癱瘓、有的轉(zhuǎn)圈，開(kāi)始未引起注意，慢慢開(kāi)始增多，按照維生素B1缺乏治療，未見(jiàn)效果，后來(lái)發(fā)展到神經(jīng)癥狀伴隨下痢、嘔吐、腹瀉，最后死亡。畜主帶病死水貂來(lái)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，經(jīng)細(xì)菌分離檢測(cè)、生化試驗(yàn)、PCR基因擴(kuò)增確診為李氏桿菌，通過(guò)藥敏試驗(yàn)選擇敏感性高的藥物治療，最終控制了病情。李氏桿菌在水貂上發(fā)病較少，都是散發(fā)，一般不被重視，有的僅僅作為神經(jīng)性腦炎治療，現(xiàn)就這次李氏桿菌的分離鑒定介紹如下。
李氏桿菌可以感染多種畜、禽、野生動(dòng)物和人，是一種嚴(yán)重的人畜共患傳染病，引起多種動(dòng)物的流產(chǎn)、敗血癥、腦膜腦炎等臨床特征，在食品安全上有重要性，李氏桿菌屬的代表是單核細(xì)胞增多性李氏桿菌，該菌是人和動(dòng)物李氏桿菌病的病原體，是致死性食源性條件致病菌。李氏桿菌寄生在多種冷血?jiǎng)游矧纭⑾墶⒗ハx(chóng)、魚(yú)蝦和甲殼動(dòng)物體內(nèi)，環(huán)境中廣泛存在于江河湖、沼澤污泥、屠宰廢棄物、飼草、墊料、肉奶蛋以及水產(chǎn)品中。土壤污染和攝入被污染的飼料是李氏桿菌的主要傳播媒介，青貯飼料pH值高于5.5加快李氏桿菌的繁殖，是該病傳播的主要方式，被稱(chēng)為“青貯病”。李氏桿菌病在不同動(dòng)物上癥狀不同，在禽類(lèi)和嚙齒類(lèi)發(fā)病主要癥狀是壞死性肝炎和心肌炎，單蹄獸上發(fā)病主要是呈現(xiàn)敗血癥，反芻獸和人類(lèi)發(fā)病主要是腦炎型和流產(chǎn)，水貂、狐貍貉子多種毛皮動(dòng)物容易患該病，主要是神經(jīng)癥狀。李氏桿菌是革蘭氏陽(yáng)性無(wú)芽孢小桿菌，大小0.4~0.5μm×1~2μm，常呈現(xiàn)V形排列，血瓊脂平板培養(yǎng)呈現(xiàn)明顯的溶血環(huán)菌落。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1試驗(yàn)菌株養(yǎng)殖場(chǎng)水貂發(fā)生疾病，主要是神經(jīng)癥狀，解剖從病死貂腦內(nèi)分離到一株細(xì)菌，進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)。
1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物18~22g小白鼠，購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；1.5~2kg家兔，購(gòu)自濟(jì)南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心；1~2月齡水貂，購(gòu)自濟(jì)南章丘航科特種毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。
1.1.3試驗(yàn)材料藥敏片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；微量生化反應(yīng)小管，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、SS瓊脂，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；牛血清，購(gòu)自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司；犬瘟熱病毒抗原快速檢測(cè)試紙，購(gòu)自韓國(guó)百易奧生物公司；解剖臺(tái)、剪刀、手術(shù)刀、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、試管，實(shí)驗(yàn)室常備物品。
1.1.4試驗(yàn)器具生物安全柜，蘇凈安泰BSC-1600IIA2；顯微鏡，奧林巴斯CX-31；全自動(dòng)樣品快速研磨儀，上海凈信科技Tiss-24；基因擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司TC-96/G/H(b)c；恒溫培養(yǎng)箱，三洋MCO-15AC。
1.2方法
1.2.1細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鏡檢
將發(fā)病死亡水貂外表消毒，放解剖臺(tái)解剖，無(wú)菌取心血、肝臟、肺臟、腦組織進(jìn)行載玻片涂片、染色、鏡檢，細(xì)菌分離時(shí)接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、SS瓊脂平板、10%血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、10%兔鮮血瓊脂平板，37℃溫箱培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。
1.2.2細(xì)菌的生化試驗(yàn)
無(wú)菌取10%血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落，接種10%血清馬丁肉湯培養(yǎng)基，接種后37℃溫箱培養(yǎng)24h，取樣接種各種生化反應(yīng)小管，觀察是否發(fā)酵發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、鼠李糖、海藻糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、棉實(shí)糖、糊精、水楊苷、衛(wèi)矛醇，進(jìn)行甲基紅MR和VP試驗(yàn)，觀察是否反應(yīng)，接種后第三天觀察反應(yīng)結(jié)果，有的菌緩慢發(fā)酵糖類(lèi)，留樣繼續(xù)觀察至第7天，記錄結(jié)果。
1.2.3細(xì)菌的16S rRNA分子生物學(xué)鑒定
病死水貂腦組織細(xì)菌分離，接種10%血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃溫箱培養(yǎng)24h，取菌落接種馬丁肉湯37℃溫箱培養(yǎng)18h，取1ml放入1.5ml無(wú)菌的離心管中，12000r/min離心1min，棄掉上清，加入無(wú)菌水中將菌體重懸，使用振蕩器震蕩搖勻，沸水浴7min，再冰浴5min，12000r/min離心1min，上清液作為基因擴(kuò)增的模板。設(shè)計(jì)寡核苷酸引物來(lái)擴(kuò)增16S rRNA，使用引物如下：F1-5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’,R1-5’ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3’。PCR反應(yīng)體系50μl：10*PCR Buffer(含MgCl215mmol/L，KCl500mmol/L)5μl，2.5mmol/L dNTP 4μl，引物(20umol/L)各1μl，模板2μl，ddH2O36.8μl，Taq酶(5U/ul)0.25μl。PCR反應(yīng)條件：94℃5min；94℃1min，56℃30s，72℃1.5min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。取PCR產(chǎn)物5μl用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物送交上海基因測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。提交Genbank進(jìn)行對(duì)比，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，判定細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育地位，16S rRNA以相似性97%為界限，以高于97%判定為該菌。
1.2.4病料PCR檢測(cè)
由于水貂發(fā)病主要是神經(jīng)癥狀，懷疑腺病毒、狂犬病毒、偽狂犬病毒一些病毒引起的疾病。無(wú)菌取肝、脾臟、腦組織研磨，進(jìn)行基因擴(kuò)增，檢測(cè)是否存在腺病毒、狂犬病毒、偽狂犬病毒。
1.2.5犬瘟熱試紙檢測(cè)
使用犬瘟熱抗原快速檢測(cè)試紙商品試紙盒內(nèi)的棉簽，取鼻液、氣管液、肺部血液在稀釋液中稀釋?zhuān)斡跈z測(cè)孔內(nèi)，待稀釋液流到檢測(cè)區(qū)1min后，觀察結(jié)果，C為對(duì)照，T為檢測(cè)，C出現(xiàn)紅色線為試紙合格，可進(jìn)一步判定，T線出現(xiàn)紅色為犬瘟熱陽(yáng)性，T線無(wú)色為犬瘟熱陰性。
1.2.6細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)
按照藥敏紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，將分離菌均勻涂抹在10%血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，把相應(yīng)的頭孢喹肟、頭孢噻呋、頭孢曲松、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、阿奇霉素、丁胺卡那霉素、壯觀霉素、強(qiáng)力霉素、多黏菌素、林可霉素藥敏片貼在平板上，37℃溫箱培養(yǎng)24h，觀察記錄抑菌圈的大小。
1.2.7細(xì)菌的毒力試驗(yàn)
病死水貂腦組織細(xì)菌分離，接種10%血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃溫箱培養(yǎng)24h，取菌落接種馬丁肉湯37℃溫箱培養(yǎng)18h，培養(yǎng)液腹腔注射18~22g小白鼠，0.5ml/只；將菌液接種1.5~2kg家兔眼睛結(jié)膜內(nèi)，1ml/只；將菌液肌肉注射1~2月齡水貂，1ml/只，接種注射后連同對(duì)照組觀察7d。
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