不同涂布方法與平板放置時間對乳酸菌的平板菌落計數(shù)法的影響
【摘要】目的研究不同涂布方法與平板放置時間對于平板菌落計數(shù)法的影響，為微生物計數(shù)研究提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。方法分別比較圓形、井字、先圓形后井字和90°轉(zhuǎn)動平板橫線涂布方法以及平板放置3、6、9 h和12 h對于副干酪乳桿菌在乳酸細菌培養(yǎng)基（MRS）平板菌落計數(shù)的影響，并做分析。結(jié)果不同涂布方法對于活菌數(shù)的影響不明顯，而對于同一涂法方法來說，平板放置12 h后，微生物生長的菌落數(shù)最低。不同涂布方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均大約在10%以內(nèi)。結(jié)論在涂布平板做乳酸菌菌落計數(shù)時，同一稀釋度下，無論以何種涂布方式，將菌液均勻涂開即可達到菌落計數(shù)目的，但是菌落計數(shù)的最佳范圍應(yīng)該在平板放置6～9 h以內(nèi)。
平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋，在規(guī)定的條件下培養(yǎng)后，所得1 ml或1 cm2樣品中含菌落的總數(shù)。一般認為，一個肉眼可見的菌落代表原樣品中的一個單細胞。選擇合適的稀釋度并乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)就可以獲得樣品中微生物的數(shù)量。平板菌落計數(shù)法以其重復(fù)性好，能真實地反應(yīng)樣品中活菌數(shù)量的優(yōu)勢成為我國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的公認可行的方法，并且在食品藥品研究領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。尤其在醫(yī)藥方面，控制口服制劑中微生物的污染狀況是藥品質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，也是評價企業(yè)各生產(chǎn)環(huán)節(jié)衛(wèi)生狀況的重要手段和依據(jù)。另一方面，平板菌落計數(shù)法也可用于檢測活菌制劑類藥物的活菌數(shù)量。乳酸菌是食品工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)中被廣泛應(yīng)用的菌株之一，其活菌數(shù)的多少直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量和功能。因此，研究乳酸菌的平板菌落計數(shù)法的影響因素有助于提高其檢測的準(zhǔn)確程度，進而有效控制藥品制作中微生物數(shù)量，提高產(chǎn)品品質(zhì)。現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。
1、材料與方法
1.1材料MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，吐溫（Tween）-80 1 ml，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸氫二銨2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水定容至1000 ml，調(diào)節(jié)pH值至5.8，121℃滅菌15 min，用于菌體的活化。MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基添加2%（W/V）的瓊脂粉，121℃滅菌15 min，用于菌落計數(shù)。BCN1360型生物潔凈工作臺；DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱。
1.2方法菌體的活化從-80℃取出嗜酸乳桿菌復(fù)蘇純化，37℃、14 h活化兩代。
1.2.1菌懸液的制備將上述活化后的第三代嗜酸乳桿菌菌液用0.85%（W/V）的無菌氯化鈉溶液分別梯度稀釋至10-5、10-6、10-7，備用。
1.2.2涂布方法及平板放置時間的影響檢測分別采用圓形、井字、先圓形后井字和90°轉(zhuǎn)動平板橫線4種涂布方法，將10-5、10-6、10-7三個稀釋度的菌液涂布在分別放置了3、6、9、12 h的MRS平板上。37℃培養(yǎng)48 h后，挑選菌落數(shù)在30～300的平板計數(shù)。
2、結(jié)果
2.1不同涂布方法對于活菌數(shù)的影響不明顯，而對于同一涂布方法來說，平板放置12 h后，微生物生長的菌落數(shù)最低。見圖1。
2.2通過觀察發(fā)現(xiàn)不同涂布方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均大約在10%以內(nèi)。見表1。
3、討論
“2.1結(jié)果”可能是由于培養(yǎng)基在放置12 h后內(nèi)部的水分活度沒有其他時間段利于微生物的生長。由于在試驗過程中發(fā)現(xiàn)平板放置3 h時培養(yǎng)基表面較滑，不利于涂布操作。綜合考慮，選擇放置6～9 h的平板更適于菌落計數(shù)。
測定樣品中的菌數(shù)方法主要有顯微鏡直接計數(shù)法、平板菌落計數(shù)法、濁度測量法、粒子計數(shù)法、三磷酸腺苷（ATP）生物發(fā)光法、電阻抗測量法、放射測量法、接觸酶測量法等。這些方法都存在各自的適用范圍及優(yōu)缺點。平板菌落計數(shù)法具有能檢測出活菌數(shù)，更真實地反映樣品狀況以及重復(fù)性好，樣品中菌數(shù)高或低都適用的特點，因此在藥品研究及實踐中廣泛應(yīng)用。但是對于平板菌落計數(shù)法的影響因素研究卻甚少，通過本研究發(fā)現(xiàn)，涂布方法對于平板菌落計數(shù)的影響是不顯著的。相反，平板的放置時間對于最終菌落計數(shù)的結(jié)果有顯著性影響，當(dāng)培養(yǎng)基放置時間過長（>12 h）時，水分活度的改變會影響所培養(yǎng)微生物的生長。這利于提高平板菌落計數(shù)的準(zhǔn)確性，對更好地控制食品、藥品中微生物的數(shù)量具有重要意義。
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