綜述微生物修復(fù)菲污染中降解菌的菌屬、降解機(jī)理、分子機(jī)制、影響因素（三）
3、分子水平的研究
微生物降解作為去除土壤PAHs的主要方式，對(duì)其研究重點(diǎn)不再停留于單一尋找降解菌屬，而是深入探究其遺傳調(diào)控機(jī)制的同時(shí)構(gòu)建高效工程菌。隨著研究范圍的不斷擴(kuò)大，對(duì)分子水平上的認(rèn)識(shí)也在不斷完善，如降解酶簇種類、編碼基因及基因坐落位置和關(guān)鍵基因的克隆等方面。
3.1降解酶簇種類
微生物降解菲是通過細(xì)胞內(nèi)一些酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。細(xì)菌利用雙加氧酶而真菌依賴單加氧酶。這些降解酶都存在兩個(gè)特性：一是降解酶的表達(dá)依賴降解物的誘導(dǎo)；二是降解酶的底物專一性差。如惡臭假單胞菌(PseudomonasputidaOUS82)，同一種雙加氧酶可以同時(shí)氧化菲、萘，而且此酶經(jīng)過萘的誘導(dǎo)后又可以將多種芳香烴氧化成酚性物質(zhì)如蒽、聯(lián)苯、硫芴、苯并苊等。以細(xì)菌為例，降解菲的過程主要涉及兩種關(guān)鍵酶，分別是羥基化雙加氧酶和鄰苯二酚雙加氧酶。
3.1.1羥基化雙加氧酶羥基化雙加氧酶(ring-hydroxylating dioxygenase,RHO)是細(xì)菌在降解菲代謝過程中的關(guān)鍵酶之一。由末端氧化酶(terminal oxygenase)和鐵氧還蛋白(ferredoxin)，以及鐵氧還蛋白還原酶(ferredoxin reductase)三部分功能蛋白組成的依賴NAD(P)H的酶系統(tǒng)。其中末端氧化酶是由ɑ亞基(含有鐵硫中心和單核鐵原子結(jié)構(gòu)域)和β亞基構(gòu)成的六聚體結(jié)構(gòu)，具有催化和識(shí)別底物的作用，鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶負(fù)責(zé)加氧過程中電子的傳遞。羥基化雙加氧酶可以催化分子氧完成對(duì)芳香環(huán)的攻擊形成羥基化產(chǎn)物。在加氧的過程中，末端氧化酶、鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白還原酶組成了一條電子傳遞鏈，鐵氧還蛋白還原酶將來自NADH的兩個(gè)電子傳給鐵氧還蛋白，由鐵氧還蛋白傳遞給具有催化和識(shí)別功能的末端氧化酶來處理。
3.1.2鄰苯二酚雙加氧酶鄰苯二酚雙加氧酶可以催化羥基化的底物使菲徹底開環(huán)，是降解代謝途徑另一個(gè)關(guān)鍵酶。包括鄰苯二酚1,2-雙加氧酶、鄰苯二酚2,3-雙加氧酶。前者屬于內(nèi)二元醇雙加氧酶，可以催化鄰苯二酚轉(zhuǎn)化為順,順-粘糠酸，斷裂發(fā)生在兩個(gè)羥基之間；后者屬于外二元醇雙加氧酶，催化鄰苯二酚轉(zhuǎn)化為2-羥基己二烯半醛，斷裂發(fā)生在某個(gè)羥基一側(cè)并且需要Fe2+的協(xié)助，由于C23O的活性依賴Fe2+，在反應(yīng)過程中部分Fe2+會(huì)被氧化成Fe從而使C23O的活性受到了影響，因此C23O催化的開環(huán)反應(yīng)是芳香化合物降解的限速步驟。在假單胞菌屬中C12O和C23O同時(shí)存在。
3.2降解基因
3.2.1降解基因的種類目前能降解多環(huán)芳烴菲的基因家族包括phd、phn、nid、nag等。其中研究最多的是phd、phn基因家族。phd基因在從毛單胞菌中的基因序列為phdAbAaBAcA dDE，其中phdAb基因編碼鐵氧化還原蛋白，phdAa基因編碼鐵氧化還原蛋白還原酶，phdB基因編碼順式-二羥基脫氫酶，phdAc和phdAd基因分別編碼鐵硫蛋白(ISP)的大(α)、小(β)亞基，phdD基因編碼異構(gòu)酶，phdE基因編碼水合酶-醛縮酶。phn基因由9個(gè)開放閱讀框(ORFs)組成，順序?yàn)閜hnRSFECDAcAdB，其中phnR、S是調(diào)控基因，phnF基因編碼乙醛脫氫酶，phnE基因編碼水合酶-醛縮酶，phnC基因編碼外源型雙加氧酶，phnD基因編碼異構(gòu)酶，phnAc基因和phnAd基因分別編碼起始雙加氧酶鐵硫蛋白(ISP)的大(α)、小(β)亞基，phnB基因編碼二羥基脫氫酶。
3.2.2降解基因的位置phn、phd、nid和nag基因家族等存在位置的多樣性，可能位于染色體上，或是存在于質(zhì)粒中，也可能兩者兼有。當(dāng)功能基因底物越復(fù)雜、降解對(duì)象含有的芳香環(huán)數(shù)量越多，其所在的操縱元就會(huì)越大，這時(shí)一般小質(zhì)粒不能承載，通常由染色體或兩者共同負(fù)擔(dān)。表3為不同降解基因編碼的蛋白及存在的位置。
3.3功能基因的研究
有關(guān)菲降解基因的研究已取得長(zhǎng)足的進(jìn)步，很多實(shí)驗(yàn)室從不同菌種中克隆得到了部分降解菲的基因片段并進(jìn)行了功能驗(yàn)證。Pinyakong等在Sphingomonassp.P2的兩個(gè)酶切片段上得到鐵硫蛋白的大小亞基基因及編碼鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶基因。Kiyohara等在Pseudomonas82的染色體DNA上得到pahAa、b、c、d及pahB、C、D、E、F的基因片段。Saito等在Pseudomonasputida中成功克隆了Nah基因。趙和平從PseudomonasputidaNCIB9816-4中克隆了nahAa、nahAb、nahAc、nahAd四個(gè)基因，分別編碼該雙加氧酶的三個(gè)組分Nap還原酶、Nap鐵氧還蛋白、鐵硫蛋白大小亞基。
表3不同降解基因編碼的蛋白及存在的位置
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