犬奇異變形桿菌及其噬菌體分離鑒定、生長(zhǎng)曲線及藥敏試驗(yàn)（一）
奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）是一種無(wú)莢膜、無(wú)芽孢、有鞭毛和菌毛的革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，是變形桿菌屬中最重要的病原菌之一。以產(chǎn)生脲酶和固體培養(yǎng)基上形成典型的遷徙運(yùn)動(dòng)能力而聞名。奇異變形桿菌是一種腐生性的條件致病菌，分布較廣，可存在于多種環(huán)境中，常見(jiàn)于土壤、污水、動(dòng)物體表、腸道等部位，能夠引起人和動(dòng)物傷口、眼睛、呼吸道、胃腸道和尿道等感染。奇異變形桿菌是繼大腸桿菌之后最易引發(fā)人泌尿道感染的細(xì)菌，可引起嚴(yán)重的泌尿道組織學(xué)損傷并與膀胱和腎臟結(jié)石的形成有關(guān)。
近年來(lái)，奇異變形桿菌作為人獸共患的病原菌，除了能夠感染人以外，還能感染雞、豬、山羊、水貂、狐貍、恒河猴等多種動(dòng)物，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，奇異變形桿菌被證明能夠抵抗多種抗生素和獲得能夠生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶拓展譜的能力，導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。
噬菌體廣泛存在于自然界，是一類可以感染并裂解細(xì)菌的病毒。噬菌體具有極強(qiáng)的宿主特異性，除對(duì)宿主菌具有裂解作用，不會(huì)感染其他正常菌群，對(duì)人和動(dòng)物無(wú)害。近年來(lái)，噬菌體在防治人和動(dòng)物疾病、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食源性感染防治應(yīng)用廣泛。特別是作為一種抗生素替代物或補(bǔ)充治療方法，在控制病原菌的傳播以及治療耐藥性細(xì)菌感染等方面取得了巨大的進(jìn)展。在當(dāng)下耐藥菌株不斷出現(xiàn)、新型抗菌藥物研發(fā)進(jìn)展緩慢的狀況下，噬菌體可作為治療感染性疾病的手段再次引起人們的關(guān)注。
前期研究從城市居民區(qū)生活污水中分離出4株奇異變形桿菌的噬菌體，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，表明其具有較好的特異性和裂解活性。周祥瑩等以貉源奇異變形桿菌為宿主菌分離出噬菌體，驗(yàn)證其體外裂解活性，為貉奇異變形桿菌病的防治提供了基礎(chǔ)。研究從感染性結(jié)石犬的尿液中分離到致病菌，通過(guò)形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、16S rRNA測(cè)序等，判定為奇異變形桿菌，并具有較強(qiáng)的耐藥性。再以分離菌株為宿主菌，從污水中分離裂解性噬菌體，命名為vB_PmM_XNR，對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，同時(shí)評(píng)價(jià)裂解性噬菌體對(duì)奇異變形桿菌的體外裂解活性，以期為治療和控制奇異變形桿菌感染和研制新型抗菌制劑奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1主要藥品與試劑
LB培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯、Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基、亞碲酸鈉卵黃增菌液、尿素酶瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自海博（青島）生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組提取、DNA純化回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；革蘭氏染色試劑盒、透析袋購(gòu)自索萊寶（北京）科技有限公司；DNA Ladder Marker、PCR Mix，購(gòu)自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司；其他常規(guī)試劑均為分析純。聚乙二醇8000購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。
電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；低溫冷離心機(jī)（德國(guó)艾本德股份公司）；JEM-2100 Plus透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）；Bio-Rad S1000TMPCR儀（美國(guó)BIO-RAD S1000）。
1.2細(xì)菌分離及生物學(xué)特性分析
1.2.1細(xì)菌分離
病料采自于大慶市農(nóng)大動(dòng)物醫(yī)院。無(wú)菌采取犬膀胱尿液，2 000 r·min-1離心5 min，棄去尿液上清液，將沉淀物接種于Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基和血瓊脂固體培養(yǎng)基上，置37℃培養(yǎng)24 h后，挑取典型菌落進(jìn)行分離純化，染色鏡檢。
為了進(jìn)一步觀察分離菌株的形態(tài)特征，取純化的菌液10μL（105CFU·mL-1）置于銅網(wǎng)，靜置15 min左右，用濾紙吸干多余液體，用負(fù)染液（2%磷鎢酸溶液）染色5 min，濾紙吸干染液后，用蒸餾水清洗2遍，干燥后置于透射電鏡（JEM-2100 Plus，JEOL，日本）觀察。
1.2.2溶血能力檢測(cè)
將分離純化的細(xì)菌劃線接種到新鮮配置的血瓊脂培養(yǎng)基（脫纖維羊血5%），置于37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，觀察細(xì)菌。
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