基于體外重組雞傳染性貧血病毒生長(zhǎng)曲線研究復(fù)制效率（一）
摘要：為研制新型雞傳染性貧血（CIA）高效疫苗以解決國(guó)內(nèi)商品雞群中普遍存在的雞傳染性貧血病毒（CIAV）感染問題，試驗(yàn)利用CRISPR-Cas9技術(shù)和Cre-LoxP系統(tǒng)，以血清4型禽腺病毒（FAdV-4）為載體，構(gòu)建表達(dá)CIAV VP1蛋白的重組FAdV-4。通過間接免疫熒光試驗(yàn)和蛋白免疫印跡試驗(yàn)對(duì)重組病毒進(jìn)行驗(yàn)證，通過體外病毒生長(zhǎng)曲線來研究其復(fù)制效率。結(jié)果顯示：該重組病毒構(gòu)建成功，能有效表達(dá)CIAV VP1蛋白，命名為rFAdV-4-CIAV-VP1，且發(fā)現(xiàn)rFAdV-4-CIAV-VP1在LMH細(xì)胞中的復(fù)制效率遠(yuǎn)低于野生型FAdV-4。研究表明構(gòu)建的重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1為CIAV和FAdV-4的聯(lián)防聯(lián)控提供了二聯(lián)候選疫苗株。
雞傳染性貧血病毒（Chicken infectious anemia virus，CIAV）感染主要引起以雛雞再生障礙性貧血與全身性淋巴組織萎縮為特征的免疫抑制性疾病，同時(shí)導(dǎo)致機(jī)體對(duì)其他病原易感性增加以及對(duì)疫苗免疫應(yīng)答降低。盡管CIA商品化弱毒活疫苗在種雞中使用廣泛，國(guó)內(nèi)商品雞群中CIAV與其他病毒的混合感染較為普遍，嚴(yán)重制約了國(guó)內(nèi)養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展。CIA商品化弱毒活疫苗不適用于免疫雛雞，對(duì)雛雞存在潛在的感染致病風(fēng)險(xiǎn)。由于在細(xì)胞和雞胚上均很難獲得高滴度的CIAV，迄今為止，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上尚無商品化的CIAV滅活疫苗的報(bào)道。有研究報(bào)道，將重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中共同表達(dá)VP1和VP2蛋白的細(xì)胞裂解物去免疫雞群，可以有效刺激雞群產(chǎn)生中和抗體，且該抗體可以保護(hù)子代雞免受CIAV感染。然而，目前同樣缺少基于重組桿狀病毒的CIA亞單位商品化疫苗。因此，研發(fā)新型CIA疫苗對(duì)高效免疫防控CIA及其他病毒病至關(guān)重要。
血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4）感染主要導(dǎo)致肝炎-心包積液綜合征。自從1987年在巴基斯坦報(bào)道以來，F(xiàn)AdV-4逐漸向周邊國(guó)家擴(kuò)散。2015年以來，國(guó)內(nèi)雞群大面積暴發(fā)高致病性FAdV-4，雞群感染死亡率高達(dá)30%~80%，對(duì)國(guó)內(nèi)養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。值得注意的是，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CIAV感染可大大降低雞群對(duì)FAdV-4疫苗的免疫應(yīng)答。最近，本課題組利用CRISPR-Cas9技術(shù)編輯FAdV-4的fiber-2基因，分別創(chuàng)制了EGFP與Fiber-2融合，EGFP代替Fiber-2以及Fiber-2部分缺失的重組FAdV-4基因工程弱毒候選疫苗，證明了fiber-2基因的可編輯性以及FAdV-4作為載體開發(fā)表達(dá)外源基因的重組基因工程疫苗的可行性。為研制新型CIA高效疫苗以解決國(guó)內(nèi)商品雞群中普遍存在的CIAV感染問題，本試驗(yàn)利用CRISPR-Cas9技術(shù)和Cre-LoxP系統(tǒng)，將FAdV-4中的fiber-2基因替換為CIAV的保護(hù)性抗原基因VP1，成功獲得了表達(dá)CIAV的VP1蛋白的新型重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1，從而為探索有效防控CIAV和FAdV-4感染的新技術(shù)奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
1.1.1細(xì)胞、病毒、抗體和質(zhì)粒
雞肝癌細(xì)胞系（LMH）來源于美國(guó)菌種保藏中心（ATCC），在含有10%胎牛血清（購(gòu)自Lonsera公司）的Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12（購(gòu)自Gibco公司）培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃、5%CO2。所用的CIAV毒株T1P6和FAdV-4毒株SD2015均由本實(shí)驗(yàn)室分離、保存。表達(dá)綠熒光蛋白（EGFP）的重組FA4-EGFP由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。抗CIAV VP1蛋白的單克隆抗體2E3，抗FAdV-4 Hexon蛋白的單克隆抗體1B5，抗FAdV-4 Fiber-2的單克隆抗體1C9，抗FAdV-4的Fiber-1蛋白的單克隆抗體3B5和抗FAdV-4的多克隆抗體雞血清均由本實(shí)驗(yàn)室制備、保存。攜帶紅色熒光蛋白（RFP）表達(dá)盒的質(zhì)粒pMD19-HAL-LoxP-RFP-LoxP-HAR和表達(dá)Cre重組酶的質(zhì)粒pcDNA3.1-Cre均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。
1.1.2主要試劑及儀器
主要試劑：2×Taq Master Mix、Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶、DL5000 DNA Marker、核酸膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和一步克隆法試劑盒（CloneExpressTM II One Step Cloning Kit）均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DNA Super Marker、RIPA裂解液（強(qiáng)）和ECL超敏發(fā)光液均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Mirus購(gòu)自MIRUS公司；Opti-MEM培養(yǎng)基和蛋白Marker均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；蛋白酶和磷酸酶抑制劑購(gòu)自蘇州新賽美公司；GAPDH單抗購(gòu)自武漢艾博抗有限公司；羊抗鼠IgG-HRP購(gòu)自Jackson Immuno Research公司；羊抗鼠IgG-FITC和羊抗雞IgG-FITC均購(gòu)自KPL公司。
構(gòu)建重組病毒策略見圖1：
主要儀器：ETC811型PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；DK-8D型37℃恒溫水浴鍋購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BB15型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；MQL-61R型恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱購(gòu)自上海旻泉儀器有限公司；5804R型低溫超速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；Tanon 2500型凝膠成像系統(tǒng)與Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)均購(gòu)自TANON公司；SW-CJ-2F型醫(yī)用凈化工作臺(tái)購(gòu)自蘇州安泰空氣技術(shù)公司；Ti2-U型倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司。
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