煙草黑脛病菌對(duì)氟嗎啉與甲霜靈的藥敏性分析（一）
煙草黑脛病(Tobacco black shank)是一種土傳病害，其病原菌為疫霉菌煙草變種(Phytophthora parasitica var.nicotianae)。20世紀(jì)80年代后期，由于我國(guó)煙草種植面積不斷擴(kuò)大，從而使煙草黑脛病迅速擴(kuò)展。化學(xué)防治是煙草黑脛病防控的重要措施，其中甲霜靈、烯酰嗎啉、氟嗎啉、霜霉威、惡霉靈等殺菌劑在生產(chǎn)中使用較為廣泛。甲霜靈是苯酰胺類內(nèi)吸性殺菌劑，其作用機(jī)制為抑制病原菌的RNA聚合酶活性。目前不同的病原卵菌對(duì)甲霜靈均具有抗性，羧酸酰胺類殺菌劑作為苯酰胺類殺菌劑的替代藥劑，對(duì)病原卵菌具有高效的抑菌活性。氟嗎啉是一種肉桂酰胺類殺菌劑，對(duì)由霜霉屬、假霜霉屬、疫霉屬等引起的卵菌病害具有優(yōu)異的保護(hù)和治療效果，但關(guān)于煙草黑脛病菌對(duì)氟嗎啉的敏感性、抗藥性研究尚未見報(bào)道。
化學(xué)藥劑復(fù)配可以減少農(nóng)藥的使用量，延緩抗藥性的發(fā)生，降低生產(chǎn)成本，是抗性治理的重要措施之一。生防菌株是天然存在的生物活體，具有良好的環(huán)境相容性。“生物-化學(xué)”協(xié)同防治可減輕化學(xué)藥劑對(duì)環(huán)境的壓力，具有廣闊的應(yīng)用前景。研究表明，將枯草芽孢桿菌或井岡霉素與殺菌劑復(fù)配可防治多種作物病害。奚家勤等從煙草品種K326葉片中分離了一株內(nèi)生細(xì)菌ZY-9-13，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌，對(duì)包括煙草黑脛病在內(nèi)的多種病原菌均具有抑制作用，能抑制病原菌菌絲的生長(zhǎng)和孢子的萌發(fā)。將該菌株與煙草育苗基質(zhì)混合使用或在煙草植株移栽時(shí)施入根際周圍，對(duì)煙草黑脛病的防治效果顯著。目前，防治煙草黑脛病的化學(xué)藥劑有限，將生防菌劑與化學(xué)藥劑協(xié)同配合防治煙草黑脛病的研究鮮見報(bào)道。為此，以從河南省分離的煙草黑脛病菌為試驗(yàn)材料，測(cè)定氟嗎啉對(duì)煙草黑脛病菌的毒力，將氟嗎啉與甲霜靈進(jìn)行二元復(fù)配，再以最佳比例的化學(xué)藥劑與解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行復(fù)配，評(píng)價(jià)其生物-化學(xué)協(xié)同作用的效果，旨在為降低殺菌劑的抗性風(fēng)險(xiǎn)、研制新型農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1煙草黑脛病菌的分離培養(yǎng)
2014—2015年從河南省三門峽市(澠池、陜縣、靈寶、盧氏)、南陽(yáng)市(淅川、內(nèi)鄉(xiāng))、平頂山市(郟縣)、周口市(鹿邑)、洛陽(yáng)市(伊川、洛寧、汝陽(yáng))共11個(gè)采樣點(diǎn)采集患黑脛病的煙株，將病組織表面消毒清洗，放在滅菌的燕麥培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)2~4 d，待長(zhǎng)出菌絲后，再次純化培養(yǎng)煙草黑脛病菌。
1.2供試藥劑
氟嗎啉標(biāo)準(zhǔn)品(有效成分97%)，甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品(有效成分98%)，均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。用二甲基亞砜配置成105μg/mL的母液，置于4℃保存。
1.3藥劑敏感性測(cè)定
采用菌落生長(zhǎng)速率法測(cè)定煙草黑脛病菌對(duì)甲霜靈和氟嗎啉的藥劑敏感性。將甲霜靈和氟嗎啉的母液分別配置成終濃度為0、0.1、0.3、0.6、1.0、3.0μg/mL和0、0.70、0.85、1.00、2.00、3.00μg/mL的藥液，按照1:1 000(體積比)等量加入燕麥培養(yǎng)基中，以只加二甲基亞砜的燕麥培養(yǎng)基為空白對(duì)照。用滅菌打孔器制取直徑為5 mm的菌餅，將菌餅菌絲面朝下接種于各個(gè)濃度的培養(yǎng)皿中央，每個(gè)濃度3次重復(fù)。25℃恒溫培養(yǎng)，待空白對(duì)照的菌落直徑生長(zhǎng)到6~8 cm時(shí)，采用十字交叉法測(cè)定處理菌落的直徑。藥劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制率的計(jì)算公式為：
以藥劑濃度的對(duì)數(shù)為x軸，抑制率的機(jī)率值為y軸，根據(jù)兩者間的線性關(guān)系，計(jì)算出毒力回歸曲線方程y=bx+a及其相關(guān)系數(shù)r，求出藥劑對(duì)病原菌的有效抑制中濃度EC50。根據(jù)煙草黑脛病菌敏感性的分布情況，建立煙草黑脛病菌對(duì)氟嗎啉的敏感基線。
1.4復(fù)配藥劑的聯(lián)合毒力測(cè)定
在單劑毒力測(cè)定的基礎(chǔ)上，按氟嗎啉:甲霜靈體積比為1:10、3:20、1:5、3:10、2:5、1:2、3:5、4:5、1:1、2:1、3:1、5:1共12個(gè)復(fù)配比例測(cè)定復(fù)配藥劑的抑菌率，每個(gè)復(fù)配比例設(shè)置6個(gè)濃度梯度，藥劑終濃度為0、0.3、0.5、0.7、1.0和3.0μg/mL。采用Wadley方法對(duì)復(fù)配制劑進(jìn)行聯(lián)合作用評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)公式為：
式中：a、b分別為氟嗎啉與甲霜靈的復(fù)配比例，%；EC(A)50為氟嗎啉的有效抑制中濃度，μg/mL；EC(B)50為甲霜靈的有效抑制中濃度，μg/mL。
式中：EC50(th)為混劑的理論有效抑制中濃度，μg/mL；EC50(ob)為混劑的實(shí)測(cè)有效抑制中濃度，μg/mL。
SR≤0.5，表明兩種藥劑復(fù)配具有拮抗作用；SR在0.5~1.5時(shí)，表明兩種藥劑復(fù)配具有相加作用；SR≥1.5，表明兩種藥劑復(fù)配具有增效作用。
相關(guān)新聞推薦
1、不同溫度、pH值、光照及培養(yǎng)基對(duì)灰葡萄孢、黃曲霉菌株生長(zhǎng)影響
2、濃香型白酒窖底泥和窖壁泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析
4、忍冬提取液對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞形態(tài)和生物膜形成能力的影響（三）