巨大芽孢桿菌BM24生長(zhǎng)曲線、耐藥性、益生潛力評(píng)估及藥敏試驗(yàn)（三）
2結(jié)果與分析
2.1分離菌株鑒定結(jié)果
2.1.1形態(tài)學(xué)鑒定
分離菌株在LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)后單菌落呈淡黃色圓形或橢圓形，微凸起，不透明，表面光滑，邊緣整齊(圖1-A);革蘭氏染色結(jié)果顯示該菌株為革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌(圖1-B);芽孢染色可見(jiàn)內(nèi)生孢子(圖1-C)。
圖1分離菌株形態(tài)A:LB瓊脂平板上的形態(tài);B:革蘭氏染色(100×);C:芽孢染色(100×)。
2.1.2生化鑒定
如表1所示，對(duì)分離菌株的生化鑒定結(jié)果為V-P、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、明膠液化、pH 5.7生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，檸檬酸鹽、丙酸鹽、7%氯化鈉、硝酸鹽還原、淀粉水解試驗(yàn)結(jié)果呈陰性。據(jù)此，初步判斷該分離菌株為芽孢桿菌屬。
表1分離菌株的生化鑒定結(jié)果“+”表示陽(yáng)性反應(yīng)，“-”表示陰性反應(yīng)。
2.1.3 16S rRNA基因序列分析
分離菌株16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小約為1 500 bp(圖2)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后結(jié)果制作進(jìn)化樹(shù)(圖3)，分離菌株序列與NCBI上已發(fā)布的巨大芽孢桿菌基因組序列同源相似性均在90%以上，因此確定該分離菌株為巨大芽孢桿菌，將其命名為巨大芽孢桿菌BM24。
圖2分離菌株16S rRNA基因序列鑒定結(jié)果M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000;+:陽(yáng)性對(duì)照;NC:陰性對(duì)照;BM24:分離菌株。
圖3分離菌株和芽孢桿菌屬細(xì)菌進(jìn)化樹(shù)Bacillus:芽孢桿菌屬;Bacillus megateriun:巨大芽孢桿菌;Bacillus aryabhattai:阿氏芽孢桿菌;Bacteria:細(xì)菌;starin:菌株。
2.2羊源巨大芽孢桿菌BM24的益生潛力評(píng)估結(jié)果
2.2.1耐酸性
由圖4可知，羊源巨大芽孢桿菌BM24能夠在不同的pH下存活，在pH 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的條件下培養(yǎng)4 h后，其相對(duì)存活率分別為28.28%、27.33%、73.63%、100.37%、103.24%、97.98%。
圖4羊源巨大芽孢桿菌BM24在不同pH條件下的相對(duì)存活率
2.2.2耐膽鹽
由圖5可知，羊源巨大芽孢桿菌BM24在0.1%、0.2%、0.3%膽鹽條件下培養(yǎng)4 h后，相對(duì)存活率分別為47.93%、48.66%、49.95%，表現(xiàn)出較好的膽鹽耐受性。
圖5羊源巨大芽孢桿菌BM24在不同濃度膽鹽條件下的相對(duì)存活率
2.2.3藥敏試驗(yàn)
選取15種常用抗菌藥物對(duì)羊源巨大芽孢桿菌BM24進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明該菌株除對(duì)克林霉素與青霉素G耐藥、紅霉素中度敏感外，對(duì)其余12種抗菌藥物均表現(xiàn)出敏感性(表2)。
表2羊源巨大芽孢桿菌BM24藥敏試驗(yàn)結(jié)果
2.2.4溶血活性
如圖6所示，羊源巨大芽孢桿菌BM24在綿羊血平板上生長(zhǎng)良好，菌落周圍無(wú)溶血環(huán)，表明其無(wú)溶血活性。
圖6羊源巨大芽孢桿菌BM24在血瓊脂平板上形態(tài)
2.2.5抗菌活性
由表3可知，羊源巨大芽孢桿菌BM24對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均有抑制效果，其中對(duì)沙門氏菌及大腸桿菌的抑制效果較強(qiáng)。
表3羊源巨大芽孢桿菌BM24抑菌試驗(yàn)結(jié)果
2.3生長(zhǎng)曲線
羊源巨大芽孢桿菌BM24的生長(zhǎng)曲線如圖7所示，菌株在0~2 h為生長(zhǎng)遲緩期，2~6 h進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，6 h后生長(zhǎng)趨于平穩(wěn)。
圖7羊源巨大芽孢桿菌BM24生長(zhǎng)曲線
2.4羊源巨大芽孢桿菌BM24的安全性評(píng)價(jià)結(jié)果
2.4.1灌胃小鼠剖檢觀察
整個(gè)試驗(yàn)期間，試驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠均未見(jiàn)異常狀態(tài)和死亡現(xiàn)象，毛色、精神狀態(tài)和糞便均正常，口、鼻、耳及肛門處無(wú)異常分泌物。剖檢觀察時(shí)，試驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠腹腔內(nèi)主要器官均無(wú)明顯肉眼可見(jiàn)病變，2組之間無(wú)明顯眼觀差異。
2.4.2灌胃小鼠體重及臟器指數(shù)變化
由圖8可知，試驗(yàn)期間2組小鼠的體重?zé)o顯著差異(P>0.05);從表4可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組小鼠肝臟、腎臟、脾臟指數(shù)均無(wú)顯著變化(P>0.05)。
圖8灌胃羊源巨大芽孢桿菌BM24對(duì)小鼠體重的影響數(shù)據(jù)點(diǎn)上方標(biāo)注的數(shù)據(jù)為t檢驗(yàn)的P值。
表4灌胃羊源巨大芽孢桿菌BM24對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響
2.4.3灌胃小鼠血細(xì)胞指標(biāo)變化
如表5所示，灌胃羊源巨大芽孢桿菌BM24后小鼠血細(xì)胞指標(biāo)與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異(P>0.05)。
表5灌胃羊源巨大芽孢桿菌BM24對(duì)小鼠血細(xì)胞指標(biāo)的影響
2.4.4腹腔注射小鼠剖檢觀察
腹腔注射后的7 d觀察期間試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠均未見(jiàn)異常癥狀和死亡現(xiàn)象，精神狀態(tài)良好;2組小鼠剖檢腹腔內(nèi)臟器無(wú)明顯眼觀病理變化。
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