焦化污染場地中萘降解菌株AO-4鑒定、生長、降解機理及環境條件帶來的影響（二）
1材料和方法
1.1實驗材料及儀器
1.1.1土壤樣品的采集
供試土壤采集于山西省某煤焦化工污染場地，隨機采集多個取樣點的表層（0～10cm）土壤，將采集到的土壤樣品用2mm土壤篩進行篩分，剔除雜質。充分混勻后，于4℃冰箱中保存。
1.1.2化學試劑
本研究所使用的主要藥品：萘、芴、菲等PAHs（純度大于97%，美國Aladdin公司）；甲醇、乙酸乙酯等有機試劑（色譜純，美國Fisher Chemical公司）；蛋白胨等非有機試劑（分析純，上海生工生物工程公司化學試劑）。
1.1.3實驗儀器
BCV-1FD超凈工作臺（上海一恒科學儀器有限公司）、LRH生化培養箱（上海一恒科技有限公司）、Agilent 1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技（中國）有限公司）、THZ-C恒溫振蕩培養箱（蘇州培英實驗設備有限公司）、LS-50H立式壓力蒸汽滅菌鍋（江陰濱江醫療設備有限公司）、UV8000S紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）、KH20R高速冷凍離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）、Nikon YS100生物顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]、SC850全自動凝膠成像系統（上海山富科學儀器有限公司）、veriti96 PCR儀（賽默飛世爾科技有限公司）。
1.2實驗方法
1.2.1試劑配置
實驗用培養基包括LB培養基和MSM無機鹽培養基，配方如下。
LB養基：蛋白胨10.00g/L，酵母膏10.00g/L，NaCl 5.00g/L，pH=7.2。
MSM無機鹽培養基：K2HPO4·3H2O 4.25g/L，NaH2PO4·H2O 1.00g/L，NH4Cl 2.00g/L，MgSO4·7H2O 0.20g/L，FeSO4·7H2O 0.012g/L，MnSO4·H2O 0.003g/L，ZnSO4·7H2O 0.003g/L，CoSO4·7H2O 0.001g/L，pH=7.0～7.2。
配置時按以上濃度稱量，用蒸餾水定容至1000mL，固體培養基配方在此基礎上加15g/L瓊脂，在121℃、0.103MPa條件下滅菌20min。
PAHs的配置：用丙酮作為溶劑配制萘（濃度為100g/L）、芴、菲、蒽、芘（濃度分別為5g/L）的溶液，通過無菌有機濾頭（孔徑0.22μm）過濾除菌，按所需濃度添加到降解體系中后，待丙酮揮發完畢使用。
1.2.2萘降解菌的篩選
取10g污染土壤加入到90mL無菌水中，于溫度30℃、轉速130r/min條件下浸取5h，靜置30min后，取5mL上清液加入到45mL以萘（100mg/L）為唯一碳源的萘選擇性液體MSM培養基中，在30℃、130r/min的恒溫振蕩培養箱中避光培養7d，然后再次轉接到新鮮的萘（150mg/L）選擇性液體培養基中繼續培養，如此重復。經7個周期馴化培養，逐步將萘的濃度提升至400mg/L后，取適量富集培養液，梯度稀釋后涂布在含萘（400mg/L）的選擇性固體培養基平板上，置于30℃生化培養箱中；待菌落長出后，挑取菌落大小及形態顯著的單個菌落在含萘選擇性固體培養基上進一步純化，直至得到形態單一的純菌種。
1.2.3萘降解菌的鑒定
1.2.3.1革蘭氏染色鑒定
取少量活化后的菌液，滴加在干凈的載玻片上干燥固定后，滴加草酸銨結晶紫染色液染色2min，立即傾去染料，用細流蒸餾水沖洗直到流水為無色。再在涂菌區域滴加適量的革蘭氏碘液，作用1min后傾去多余的碘液，最后用水流沖至流出液為無色。用吸水紙吸去載玻片上多余的水分，滴加體積分數為95%乙醇脫色30s左右至流出液為無色，接著用蒸餾水沖去乙醇后吸干，番紅復染3min，水洗并使之干燥。在顯微鏡下用100倍油鏡觀察經染色的菌落顏色。
1.2.3.2 16S rDNA擴增及測序鑒定
將純化的單菌落接種到LB液體培養基中擴大培養，取新鮮菌液用細菌基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取基因組DNA。用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)擴增其16S rDNA基因序列。PCR體系為：Super Mix 20μL、ddH2O 12μL、通用引物27F(10μmol/L)1μL、通用引物1492R(10μmol/L)1μL、模板DNA 6μL。擴增條件為：94℃、30s，55℃、30s，72℃、90s，35個循環。將PCR擴增得到的產物送至北京六合華大基因科技有限公司測序，測序結果在NCBI的Genbank數據庫進行序列同源性比對，用MEGA 7.0進行同源性分析，依據鄰接法（neighbor joining）構建系統發育樹，確定萘降解菌AO-4的種屬。
1.2.4萘降解途徑中的部分關鍵酶基因的PCR擴增
選取萘降解途徑中的關鍵酶萘雙加氧酶的鐵硫蛋白大亞基基因nahAC、水楊醛脫氫酶基因nahF、水楊酸羥化酶基因nahG及鄰苯二酚2，3-雙加氧酶基因nahH進行PCR擴增與鑒定。引物序列如下。
1.2.5萘降解菌對PAHs（萘、芴、菲、蒽、芘）的降解體系
將處于對數生長期的AO-4菌液（OD600=1）按一定體積接種至含特定濃度的萘、芴、菲、蒽、芘MSM培養基中，于溫度30℃、轉速130r/min條件下搖床避光培養，定時取樣，按需測定菌體濃度OD600、培養液中PAHs含量及菌體脫氫酶活性，實驗設置三組平行試樣，并設置無菌組作為空白對照。
1.2.6環境單因素對萘降解的影響
本研究以降解率作為考察指標，研究環境因素包括溫度、pH、萘初始濃度和菌種接種量對萘降解的影響，培養條件均在30℃、130r/min的搖床避光培養。
設置體系的不同溫度分別為10℃、20℃、30℃、40℃，將處于對數生長期的菌液按2%（體積分數）的接種量接種至含有20mg/L萘的無機鹽培養基（pH=7.0）中，定時取樣測定不同溫度下菌株AO-4對萘的降解率。
調整體系的初始pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，將處于對數生長期的菌液按2%（體積分數）的接種量接種至含有20mg/L萘的無機鹽培養基中，定時取樣測定不同初始pH下菌株AO-4對萘的降解率。
選取小于萘在水中溶解度的濃度（1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L），將處于對數生長期的菌液按2%（體積分數）接種量接種至含有以上濃度的萘的無機鹽培養基（pH=7.0）中，定時取樣測定菌株AO-4對不同濃度的萘的降解率。
將處于對數生長期的菌液分別按0、1%、2%、5%的接種量（體積分數）接種至含有20mg/L萘的無機鹽培養基（pH=7.0）中，定時取樣測定不同接種量下菌株AO-4對萘的降解率。
1.2.7 PAHs濃度的測定及降解率計算
試樣用等體積的乙酸乙酯萃取，在振蕩器上通過1500r/min轉速振蕩5min后超聲萃取10min，再經10000r/min轉速離心5min后可分離有機相和水相，用0.22μm孔徑的有機濾膜過濾乙酸乙酯萃取液后，利用高效液相色譜儀（HPLC）測定各PAHs的濃度，HPLC測試條件：ZORBAX Eclipse PAHs色譜柱，紫外檢測器，柱溫30℃，流動相為甲醇和水，流速1mL/min，進樣量20μL，檢測波長220nm。
降解率η的計算依據式(1)。
式中，C0為PAHs的初始濃度，mg/L；Ct為反應t時間后PAHs的濃度，mg/L。
1.2.8脫氫酶活性的測定
通過測定微生物的脫氫酶活性可以了解微生物對有機污染物的氧化分解能力，按照文獻方法：在具塞試管中，加入降解后的培養液、Tris-HCl緩沖溶液（pH=8.5、0.05mol/L）、葡萄糖溶液（0.10mol/L）、TTC（質量分數為0.5%）各2mL，置于30℃恒溫培養箱中避光反應。反應4h后，加入400μL濃硫酸中止反應，并加入5mL甲苯，1500r/min振蕩10min進行萃取。待反應生成的紅色三苯基甲臜（TF）被完全萃取到有機相時，將有機相在4000r/min下離心5min，過濾后測定濾液于486nm處的吸光度（OD486），以此表征萘降解菌的脫氫酶活性。