香芹酚對惡臭假單胞菌生長、運動能力、產(chǎn)胞外蛋白酶和生物被膜能力影響（二）
1.3.2泳動性和群集性測定
培養(yǎng)基配制好后，按1.3.1節(jié)方法配制含有不同體積分數(shù)香芹酚的菌懸液并設(shè)置空白對照和DMSO對照。搖勻后，各接種3μL樣品溶液至泳動性和群集性平板中央。將平板于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，測量菌株蔓延分散距離。
1.3.3嗜鐵素產(chǎn)生情況測定
按1.3.1節(jié)方法配制含有不同體積分數(shù)香芹酚的菌懸液并設(shè)置空白對照和DMSO對照。培養(yǎng)基凝固后，每孔加入100μL稀釋的惡臭假單胞菌樣液。將平板于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，測量嗜鐵素平板中黃色暈圈的直徑。
1.3.4胞外蛋白酶的測定
LB營養(yǎng)瓊脂滅菌冷卻至約50℃后，將LB營養(yǎng)瓊脂與單獨滅菌的脫脂奶粉混勻，使脫脂奶粉的最終質(zhì)量分數(shù)為1.0%，倒平板，并用牛津杯打孔，備用。將惡臭假單胞菌過夜培養(yǎng)活化，并調(diào)節(jié)OD600 nm約為1.00，按1∶1 000的比例加入到LB肉湯中，按1.3.1節(jié)方法配制含有不同體積分數(shù)香芹酚的菌懸液并設(shè)置空白對照和DMSO對照。搖勻后，分別向打孔平板中加入100μL樣液，將平板置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，使用游標卡尺測量3組脫脂奶粉瓊脂平板中透明圈的直徑。
1.3.5生物被膜形成能力的測定
將惡臭假單胞菌過夜活化至OD600 nm約為1.00，用LB肉湯以1∶100的比例稀釋，按1.3.1節(jié)方法配制含有不同體積分數(shù)香芹酚的菌懸液，同時做空白對照和DMSO對照。取200μL上述菌液于96孔板中，將96孔板置于30℃培養(yǎng)箱下靜置培養(yǎng)24 h，吸去孔中的菌液，殘留生物被膜用200μL去離子水洗滌3次。向每個生物被膜孔添加200μL 0.1 g/100 mL結(jié)晶紫溶液，28℃染色20 min。染色后的生物被膜用200μL去離子水沖洗3次，吸干，最后加入等體積95%乙醇洗脫5 min后，使用酶標儀測定OD600 nm，以此表征惡臭假單胞菌的生物被膜形成能力。
1.3.6核酸泄漏量的測定
將惡臭假單胞菌接種至肉湯培養(yǎng)基，于28℃水浴振蕩器中活化24 h，吸取菌懸液于4℃、8 000 r/min離心5 min后收集沉淀，并用磷酸鹽緩沖溶液洗滌、重懸并調(diào)整菌懸液至OD600 nm約為1.00，按1.3.1節(jié)方法配制含有不同體積分數(shù)73香芹酚的菌懸液并設(shè)置空白對照和DMSO對照。將樣品置于28℃水浴振蕩器中振蕩培養(yǎng)活化，分別于15、30、45、60 min取菌懸液，4℃、8 000 r/min離心5 min，使用移液器吸取上清液，并用紫外-可見分光光度計測定OD260 nm。
1.3數(shù)據(jù)處理
每組實驗做3次以上平行重復，采用IBM SPSS Statistics 26軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan’s多重比較對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，P＜0.01表示差異極顯著；采用Origin 2021軟件作圖。
2結(jié)果與分析
2.1香芹酚對惡臭假單胞菌生長曲線的影響
由圖1可知，空白對照組和DMSO對照組惡臭假單胞菌生長曲線十分相似，在0～6 h生長迅速。采用香芹酚處理后，惡臭假單胞菌的生長速率變緩，且隨著香芹酚含量升高，其生長受到的抑制愈加明顯。與2個對照組相比，香芹酚體積分數(shù)為0.005%時，惡臭假單胞菌的生長受到輕微抑制，香芹酚體積分數(shù)為0.010%時，惡臭假單胞菌生長受到明顯抑制。當香芹酚體積分數(shù)≥0.015%時，其延遲期延長至16 h以上，且在16 h以后，其生長也十分緩慢。結(jié)果表明，當香芹酚在體積分數(shù)≥0.015%時對惡臭假單胞菌的生長具有良好的抑制作用。
圖1不同體積分數(shù)香芹酚對惡臭假單胞菌生長的影響
2.2香芹酚對惡臭假單胞菌泳動性和群集性的影響
由圖2A可知，空白對照組和DMSO對照組的泳動性菌落較大，表明惡臭假單胞菌具有較強的運動能力。隨香芹酚含量升高，惡臭假單胞菌的移動距離呈現(xiàn)明顯減小趨勢，當香芹酚體積分數(shù)≥0.010%時，對惡臭假單胞菌的泳動性有明顯的抑制作用。由圖2B可知，隨香芹酚含量升高，惡臭假單胞菌的移動距離呈現(xiàn)明顯減小趨勢，當香芹酚體積分數(shù)≥0.015%時，對惡臭假單胞菌的群集性有明顯的抑制作用。結(jié)果表明，香芹酚可明顯削弱惡臭假單胞菌的運動能力，且體積分數(shù)越大，效果越好。Wang Yaying等研究香芹酚對熒光假單胞菌泳動性和群集性的影響發(fā)現(xiàn)，香芹酚對熒光假單胞菌的運動有很強的抑制作用，與本研究結(jié)果較為一致。
圖2不同體積分數(shù)香芹酚對惡臭假單胞菌泳動性（A）和群集性（B）的影響
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