釀造產香魯氏接合酵母耐溫、耐鹽的營養需求特點與逆境響應差異
魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是一種重要的產香食品酵母，在醬油釀造中發揮著重要作用，也是食品腐敗微生物之一。長期以來，魯氏接合酵母具備兩種截然相反的特點，對高濃度鹽的高耐受性和對高溫的高敏感性。該酵母的耐鹽機理備受研究者的關注，明確了高鹽下酵母細胞的生理變化特點，篩選和鑒定出一系列耐鹽相關基因和蛋白。然而，魯氏接合酵母耐溫、耐鹽特性差異研究較少，影響了雙重抗性優良菌株的構建。
湖北工業大學生物工程與食品學院的劉夢奇、閆珍珍、李欣*等針對釀造產香魯氏接合酵母，確定了全合成最少營養組分的培養基，基于此探索酵母細胞在長時期（120 h）的高鹽（18%NaCl）和高溫（40℃）脅迫下對營養需求特點，并進一步研究從適應期到對數生長初期的有機酸代謝、氨基酸代謝、胞內相容抗逆物質和重要逆境響應調控基因表達等方面的兩種逆境響應差異。
建立全合成最低營養生長培養基
為了規避逆境非必要營養物質對代謝分析和基因表達分析的干擾，同時也為尋找逆境必須營養物提供干凈的背景，以YNB為對照培養基和出發培養基，選取酵母最適葡萄糖為唯一碳源，以脯氨酸為唯一氮源，采用單因素遞減策略對微量元素進行評估，建立魯氏接合酵母最低營養需求的全合成培養基。魯氏接合酵母在全合成培養基中及其不同逆境下的生長曲線如圖1A所示。
魯氏接合酵母2013310在YNB培養基培養120 h的最大OD600nm達到31.01±0.72，而在全合成培養基中培養120 h最大OD600nm只有14.22±1.23。同時，該酵母在全合成培養基的高溫和高鹽逆境下培養120 h的最大OD600nm只有2.44±0.13和3.87±0.12。此外，與YNB培養基相似，酵母細胞在全合成培養基中的生長曲線也顯示出清晰的適應期（0～12 h）、增殖期（12～84 h）和穩定期（84～120 h）。由此可見，全合成培養基能滿足魯氏接合酵母在正常生理環境下的生長增殖需求。魯氏接合酵母在高鹽逆境下需要大約36 h適應環境，而在高溫環境下的適應期只有大約2 h。同時，在48 h時，高鹽逆境下的魯氏接合酵母進入了對數生長前期，而高溫下的酵母細胞在4 h已經處于對數生長前期?？梢姡摻湍笇Ω邷丨h境的適應能力比高鹽逆境好。鑒于魯氏接合酵母在兩種逆境下的不同生長曲線，高溫逆境前12 h和高鹽逆境前48 h（適應期和對數生長初期）被用來研究魯氏接合酵母對兩種逆境的響應差異。
通過掃描電鏡觀察魯氏接合酵母2013310在全合成培養基及不同逆境下的形態學差異（圖1B）。在全合成培養基培養下，魯氏接合酵母菌體主要呈圓形的單細胞狀態（與正常狀態下酵母形態一致），部分表面有褶皺，有明顯的出芽現象。發酵24 h后菌體全部呈圓形或橢圓形，表面圓潤飽滿，光滑無褶皺。在高鹽條件下，酵母在48 h對數前期細胞縮小，表面出現嚴重的褶皺變化，大部分呈單細胞存在。在高溫條件下的酵母在發酵8 h后，細胞大小較全合成培養基0 h較為接近，但存在部分細胞表面出現褶皺，且分布似乎有絮凝的趨勢，這可能與高溫對酵母細胞壁蛋白質結構影響有關。高鹽脅迫比高溫脅迫對全合成培養基培養條件下酵母細胞形態影響更為顯著；而相對于高溫逆境，該酵母在高鹽條件展現出更高的生長活性。
魯氏接合酵母逆境條件下的營養需求差異
酵母細胞對營養物質的獲取只有兩條途徑，自身合成或轉運外源營養物。微生物基因表達和代謝在逆境下會發生劇烈變化，對營養物的需求應該會發生相應的調整?？紤]到高溫逆境和高鹽逆境可能會關閉某些營養物的自身合成途徑，使得酵母細胞對營養物獲取的方式發生變化，因此，分析全合成培養基中8種有機酸、7種維生素、7種核苷類物質和14種氨基酸對酵母細胞生長的影響，將有助于闡明魯氏接合酵母在面對高溫逆境和高鹽逆境時的營養需求差異。
高鹽逆境下的魯氏接合酵母2013310的生長不需要額外有機酸，但丙酮酸和草酰乙酸卻能促進高溫逆境下酵母細胞的增殖，較對照分別提高了34.5%和24.2%（。無論是高鹽還是高溫逆境，魯氏接合酵母2013310對丙酸和正丁酸敏感。這兩種有機酸幾乎完全抑制了高鹽逆境下酵母細胞的生長。高溫逆境下，添加丙酸、正丁酸的魯氏接合酵母2013310 OD600nm較對照（OD600nm＝2.81）分別降低了85.1%、74.0%。高鹽逆境下，不同類型維生素對魯氏接合酵母高鹽脅迫下生長無顯著效果；高溫逆境下，維生素的添加，在整體上促進了菌體生長，其中添加硫胺素菌體OD600nm較對照（OD600nm＝2.51）提高了1.47倍。不同類型核苷酸在兩種條件下對魯氏接合酵母2013310生長均無顯著影響。
氨基酸的添加對高鹽和高溫脅迫下的魯氏接合酵母2013310生長有明顯影響。高鹽逆境下，蛋氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、色氨酸均能緩解菌體所受高鹽脅迫，OD600nm較對照分別提高2.72、3.40、2.73倍和2.42倍；高溫逆境下，能緩解細胞所受脅迫的氨基酸有賴氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、亮氨酸和精氨酸，其OD600nm較對照分別提高52.0%、31.1%、49.2%、34.5%、66.2%、19.4%和57.1%。絲氨酸和半胱氨酸均并不利于魯氏接合酵母2013310耐受高鹽和高溫脅迫。
總體而言，遭遇高鹽壓力的魯氏接合酵母細胞更需要外源氨基酸，而補充維生素和氨基酸有助于緩解酵母細胞的高溫壓力。這些結果也表明，魯氏接合酵母的維生素和氨基酸自我合成代謝被高溫壓力所抑制。同時，谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸是魯氏接合酵母細胞在兩種環境壓力下均需要的氨基酸。纈氨酸和蛋氨酸是魯氏接合酵母細胞在高鹽壓力下生長所需的獨特氨基酸，而賴氨酸、天冬酰胺和精氨酸是高溫壓力下魯氏接合酵母細胞所需的獨特氨基酸。由于氨基酸是蛋白質的重要組成單位，蛋白質又參與酶的形成、物質的轉運及穩定細胞結構等，這表明有必要從蛋白層面進一步研究魯氏接合酵母對高鹽和高溫壓力響應的機理。
高鹽和高溫脅迫下魯氏接合酵母胞內外代謝物差異
有機酸具有多重生理功能，也參與了生命體核心代謝途徑，如丙酮酸溢流代謝和三羧酸循環。在選取的6種被檢測有機酸物質中，兩種逆境下的魯氏接合酵母2013310細胞的胞內均只有乙酸被檢測到，而且變化過程相似。乙酸在細胞生長適應前期（高鹽的12 h，高溫的2 h）在細胞內大量積累，最高含量分別達到（78.60±3.23）μg/g（細胞干質量，下同）和（126.30±10.56）μg/g。在隨后的12 h（高鹽）或2 h（高溫），胞內乙酸水平大幅下降，分別降為（19.54±3.56）μg/g（高鹽，24 h）和（38.30±7.02）μg/g（高溫，4 h）。此后，乙酸含量幾乎維持穩定。
在高鹽逆境下也只檢測到單一的胞外有機酸乙酸。乙酸在生長前期（0～12 h）快速積累并在12 h達到峰值（（364.09±15.65）μg/L），24 h后乙酸被快速消耗至（117.09±17.01）μg/L（36 h）。在高溫下，除了乙酸，胞外還存在多種有機酸，包括正丁醇、丙酮、丙酸、丁酸和異丁酸。除乙酸外，5種有機酸在培養的前2 h就完成了胞外的積累。乙酸在胞外持續積累，最大質量濃度達到（566.32±13.76）mg/L（10 h）。乙偶姻是一種酮類物質，是魯氏接合酵母在胞外積累的第二大化合物。乙酸代謝可能在魯氏接合酵母長期適應高溫高鹽壓力中起著重要的作用，是有機酸代謝的關鍵環節。推測乙酸的存在有利于乙酰輔酶A的合成，因為乙酰輔酶A是一種重要的抗逆中間代謝物。同時，考慮到全合成培養基的特點，胞外有機酸的出現源于胞內有機酸代謝及其分泌。相比于高鹽壓力，糖代謝在高溫壓力下更活躍?？梢?，魯氏接合酵母針對高鹽和高溫逆境采用了不同的有機酸代謝策略。無論是高鹽還是高溫脅迫，魯氏接合酵母均不會在胞內積累有機酸，這應該是避免有機酸的傷害，與前面營養需求研究結果一致。
高鹽和高溫脅迫下魯氏接合酵母抗逆代謝物的差異
微生物合成抗逆代謝產物來抵御環境壓力是一種重要的壓力響應機制。魯氏接合酵母胞內糖代謝對高鹽和高溫逆境產生了兩種截然不同的響應。高鹽逆境下的魯氏接合酵母細胞內只有鼠李糖和半乳糖。在適應初期的12 h，酵母細胞大量積累鼠李糖，而半乳糖在胞內只有少量增加，但二者在24 h下降。進入細胞生長期時，這兩種糖的胞內濃度顯著上升。與之不同，高溫逆境下魯氏接合酵母胞內存在葡萄糖、海藻糖、木糖醇和甘油。傳統上的抗逆保護劑（海藻糖和甘油）在魯氏接合酵母胞內只有極少量的積累，最大含量分別為（369.00±21.01）μg/g和（268.10±21.18）μg/g（8 h），而木糖醇水平卻顯著上升（（1 788.20±100.56）μg/g，8 h）。這表明對魯氏接合酵母2013310而言，木糖醇，而非海藻糖和甘油，是其高溫壓力下的抗逆保護劑。然而，本研究結果表明，高鹽壓力下的魯氏接合酵母細胞內沒有葡萄糖。這可能是兩個因素導致的：其一，高鹽下的魯氏接合酵母對外源葡萄糖的轉運能力不強，導致胞內葡萄糖濃度處于檢測線之下；其二，對高鹽環境下的魯氏接合酵母而言，葡萄糖可能并不是最適碳源，胞內葡萄糖被快速轉化成其他糖類物質。全合成培養基中添加木糖醇、海藻糖、甘油對魯氏接合酵母在高鹽環境下的生長均有促進作用，相比空白對照，OD600nm分別提高了115.4%、217.0%、223.9%（數據未顯示）。
結論
溫度壓力和鹽壓力是魯氏接合酵母在醬油高鹽固態發酵過程中遭遇的主要逆境。與其他環境壓力不同，微生物對這兩種逆境無法通過采用降解壓力因子的方式緩解。本研究基于低營養全合成培養基，在營養、代謝和轉錄3個層面分析了魯氏接合酵母2013310從生長適應期到對數生長初期的高鹽和高溫逆境響應?？傮w而言，該酵母采用了不同的策略來適應高溫和高鹽逆境。遭遇高鹽壓力的魯氏接合酵母細胞更需要外源氨基酸，而補充維生素和氨基酸有助于緩解酵母細胞的高溫壓力。谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸和乙酸代謝對酵母細胞適應高溫和高鹽逆境極其重要。本研究加深了對耐鹽魯氏接合酵母耐溫機制的理解。同時，微生物不同抗性之間存在交互作用。魯氏接合酵母耐高鹽的特性與對溫度的高敏感性之間的關聯性有待研究，這將有助于為雙抗逆新型魯氏接合酵母細胞株的構建提供方向和著力點。