鵪鶉肺炎克雷伯菌血清型鑒定、耐藥性檢測及致病潛力（一）
摘要：【目的】從腹瀉鵪鶉糞便樣本中分離并鑒定肺炎克雷伯菌，以期為鵪鶉肺炎克雷伯菌疾病防控提供基礎(chǔ)。【方法】從8份腹瀉鵪鶉糞便樣本中篩選純化菌落，通過平板劃線法對細(xì)菌進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，利用PCR擴(kuò)增16SrDNA序列并測序，使用Mega11.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用K-B法檢測菌株對常見抗菌藥物的敏感性，并檢測菌株中耐藥基因和毒力基因分布情況，探究其生物學(xué)特性，通過動物試驗(yàn)評估菌株的致病性。【結(jié)果】本研究從腹瀉鵪鶉糞便樣本中分離并鑒定出2株肺炎克雷伯菌，分別命名為Ksp-A1和Ksp-A2,均屬于K57血清型。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，2株分離株與其他已知肺炎克雷伯菌株相似性較高，且與肺炎克雷伯菌DB-4和WGT-31株屬于同一進(jìn)化分支。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株對氨芐西林、苯唑西林和紅霉素等表現(xiàn)耐藥。分離株Ksp-A1和Ksp-A2均攜帶多種耐藥基因，包括blaSHV、aacC2、oqxAB、tetA、tetM和cat1基因。2株分離株均攜帶毒力基因K88、hlyE、iucD、irp2、ompA和ompC.生物學(xué)特性分析顯示，在pH7.0的LB肉湯培養(yǎng)基中，分離株Ksp-A1和Ksp-A2均在2h內(nèi)進(jìn)入對數(shù)生長期，并分別在12和9h達(dá)到峰值。小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，注射菌液后，小鼠表現(xiàn)被毛粗亂、精神沉郁、呼吸急促及腹瀉等感染癥狀，且隨著菌液濃度增加，小鼠死亡率逐漸上升，菌液濃度為1×109CFU/mL時，小鼠死亡率均達(dá)100%,Ksp-A1和Ksp-A2對小鼠的半數(shù)致死劑量（LD50）分別為3.3×107和2.6×106CFU.【結(jié)論】試驗(yàn)成功分離獲得2株鵪鶉源K57型肺炎克雷伯菌，其對β-內(nèi)酰胺類藥物表現(xiàn)耐藥，生長速度較快，對酸堿耐受能力強(qiáng)。研究結(jié)果為鵪鶉源肺炎克雷伯菌疾病的防治提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae）克雷伯菌屬（Klebsiella），是一種革蘭陰性菌，常見于動物黏膜或自然環(huán)境中。肺炎克雷伯菌具有多種質(zhì)粒和可移動遺傳原件，這些遺傳原件使其攜帶多種抗性基因或者從環(huán)境中獲取新的抗性基因，再將這些耐藥基因傳給敏感菌株，從而造成超級耐藥菌株的出現(xiàn)，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。
2020年中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測報告指出，醫(yī)源肺炎克雷伯菌在醫(yī)源革蘭陰性菌中的分離率排第二，僅次于大腸桿菌，耐藥性呈明顯上升趨勢。肺炎克雷伯菌的毒力因子和血清型的研究對于理解其致病機(jī)制、制定有效的防控策略具有重要意義。其毒力因子包括莢膜（capsule）、菌毛（fimbriae）、外膜蛋白（outermembraneproteins）等，它們共同作用，增強(qiáng)了細(xì)菌對宿主的侵襲力和抵抗宿主免疫反應(yīng)的能力。
血清型研究有助于識別不同肺炎克雷伯菌株的流行病學(xué)特征，為疫情監(jiān)測和控制提供科學(xué)依據(jù)。鵪鶉作為一種常見的禽類，其飼養(yǎng)過程中的健康管理對于控制和預(yù)防耐藥菌的傳播具有重要意義。然而，目前關(guān)于肺炎克雷伯菌在鵪鶉中的流行情況、耐藥性和毒力基因的相關(guān)報道較少。有研究表明，不同宿主來源的肺炎克雷伯菌在耐藥性和分子特點(diǎn)上存在差異，這可能影響其在人與動物間的傳播。近年來，隨著養(yǎng)禽業(yè)的快速發(fā)展，鵪鶉等禽類的細(xì)菌感染率及耐藥性呈明顯上升趨勢，對禽類疾病防控構(gòu)成了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。然而，目前關(guān)于鵪鶉源病原菌的耐藥性及毒力基因分布的研究較為匱乏。本研究擬從腹瀉鵪鶉糞便樣本中分離并鑒定病原菌，通過對分離菌株的基因型和血清型鑒定、耐藥性檢測、毒力基因篩查等生物學(xué)分析，評估其耐藥機(jī)制與致病潛力，以期為相關(guān)疾病防控、疫苗開發(fā)及抗菌藥合理使用提供參考。
1材料與方法
1.1樣品來源及試驗(yàn)
動物8份12周齡鵪鶉腹瀉糞便樣品采集于新疆阿克蘇地區(qū)某養(yǎng)禽場；120只6周齡、25-30gCL級昆明小鼠（雌雄各半）購自塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院合作實(shí)驗(yàn)動物中心。
本研究所有動物試驗(yàn)嚴(yán)格遵循相關(guān)動物倫理法規(guī)，所有操作符合塔里木大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心動物福利要求。
1.2主要試劑及儀器
LB瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、均購自杭州微生物試劑有限公司；革蘭染色試劑盒購自北京酷來搏科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；2×EasyTaqPCRSuperMix（+Dye）購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。
梯度PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀均購自Bio-Rad公司；oCelloScope微生物快速藥敏監(jiān)測系統(tǒng)購自丹麥BioSense公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱購自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。
1.3病原菌的分離培養(yǎng)及生長特性鑒定
使用滅菌接種環(huán)分別將8份腹瀉鵪鶉糞便樣品劃線接種于LB瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12h.挑取疑似菌落接種于LB肉湯培養(yǎng)基，再劃線接種于LB瓊脂培養(yǎng)基，將純培養(yǎng)單菌落分別劃線接種于麥康凱瓊脂、SS瓊脂和LB瓊脂平板，觀察細(xì)菌生長狀態(tài)，使用革蘭染色試劑盒對細(xì)菌進(jìn)行染色，于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征。純培養(yǎng)菌株使用50%甘油細(xì)胞凍存管于―80℃保種備用。
1.4分離菌株的生化鑒定
將分離的純培養(yǎng)菌株接種到LB肉湯培養(yǎng)基，37℃、180r/min過夜震蕩培養(yǎng)，對純培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行生化鑒定。將預(yù)培養(yǎng)的菌液接種到各生化鑒定試劑管中，每個測試項(xiàng)目接種5-10μL菌液，并設(shè)置無菌水作為空白對照。將接種后的生化鑒定試劑板放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h.觀察并記錄每個孔中的生化反應(yīng)結(jié)果，將生化反應(yīng)評估結(jié)果與肺炎克雷伯菌的標(biāo)準(zhǔn)生化特性進(jìn)行對比，確定菌株的生化特征。
相關(guān)新聞推薦
1、低聚果糖在體外對大腸桿菌、嗜酸乳桿菌生長曲線的影響（二）
2、食品飲料加工用無菌化管道評估調(diào)試，也得監(jiān)測細(xì)菌生長曲線？
3、3株奧默柯達(dá)酵母生長曲線、pH耐受性、最適生長溫度測定及對醬油香氣和滋味影響（一）