大腸桿菌噬菌體Φ199一步生長曲線、與鹽酸克林霉素體外聯(lián)合應用效果（二）
1.3透射電鏡觀察
噬菌體培養(yǎng)至10^8 PFU/mL，取10μL轉(zhuǎn)移至銅網(wǎng)格上，靜置10 min待其吸附于銅網(wǎng)格后，用濾紙吸去多余液體，滴加10μL磷鎢酸(PTA，2%)，自然風干5 min后使用H7650透射電子顯微鏡(Hitachi，Japan)觀察噬菌體結(jié)構(gòu)。
1.4最佳MOI測定
最佳MOI是指噬菌體與細菌的數(shù)量在此比值下，噬菌體處于最佳復制狀態(tài)。O157:H7大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)期，用LB培養(yǎng)基稀釋至1×10^7 CFU/mL，用SM液稀釋噬菌體，使噬菌體與細菌的MOI為0.001、0.01、0.1、1、10和100。取200μL菌液和噬菌體液，混合均勻后置于37℃、180 r/min搖床中孵育5 h。10 000 g離心8 min，吸取上清液過濾。濾液通過10倍比稀釋以及雙層平板計數(shù)法測定噬菌體效價，效價最高的MOI為最佳感染復數(shù)。每組重復3次。
1.5一步生長曲線測定
取1 mL噬菌體Φ199和1 mL O157:H7以最佳MOI混合均勻，37℃靜置孵育10 min。孵育結(jié)束后，10 000 g離心8 min，用2 mL的LB培養(yǎng)基洗滌2次以去除沒有吸附于細菌上的噬菌體。用預熱至37℃的5 mL LB培養(yǎng)基重懸沉淀，置于37℃、180 r/min搖床中孵育，每間隔5~10 min取出菌液進行倍比稀釋，雙層平板法測定噬菌體效價。每組重復3次。
1.6裂解曲線測定
取1 mL濃度為1×10^8 CFU/mL的大腸桿菌O157:H7，用LB洗滌3次后稀釋10倍至1×10^7 CFU/mL。按照最佳MOI各取100μL噬菌體和菌液，混勻后加入96孔板中。取稀釋好的菌液和LB各100μL，混勻后加入96孔板中，作為菌液對照。取200μL LB加入96孔板中，作為空白對照。每組重復3孔。酶標儀設置參數(shù)為恒溫37℃，180 r/min震蕩，持續(xù)12 h，每30 min檢測1次OD600 nm值，將所得數(shù)值繪制體外裂解曲線。
1.7噬菌體熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性
在每個1.5 mL的EP管中加入500μL噬菌體，分別置于40、50、60、70、80和90℃中孵育，每隔30 min取出100μL噬菌體液用SM液10倍倍比稀釋，通過雙層平板法測定噬菌體效價，一共孵育1.5 h。每組重復3次。
利用鹽酸和NaOH調(diào)節(jié)SM液體的pH值，配制成pH值為2~13的SM液。在1.5 mL的EP管中分別加入900μL不同pH值的SM液和100μL的噬菌體，混勻后于37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，最后取出培養(yǎng)液進行10倍倍比稀釋以及雙層平板法測定噬菌體效價。每組重復3次。
1.8鹽酸克林霉素最小抑菌濃度(MIC)測定
采用96孔U型板測量鹽酸克林霉素的MIC。配制鹽酸克林霉素母液為256 mg/mL，用MH培養(yǎng)液稀釋至512μg/mL。在96孔板中第2~10孔每孔加入100μL MH培養(yǎng)基，在第1、2孔中加入100μL鹽酸克林霉素稀釋液，第2孔開始混勻，2倍稀釋，依次稀釋至第10孔。大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)期，用MH培養(yǎng)基稀釋至1×10^6 CFU/mL，每孔加入50μL菌液，第12孔加入50μL MH培養(yǎng)基。同時設置陽性對照組(大腸桿菌+MH培養(yǎng)基)和陰性對照組(MH培養(yǎng)基)。96孔板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。使用酶標儀檢測每孔在600 nm處OD值。每組重復3次。
1.9噬菌體Φ199和鹽酸克林霉素體外聯(lián)合應用
首先配制512μg/mL的抗生素稀釋液，在96孔板中每孔加入100μL MH培養(yǎng)液并通過倍比稀釋方法進行抗生素稀釋。大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)期，用MH培養(yǎng)基稀釋至1×10^6 CFU/mL，每孔加入50μL菌液。準備效價為10^5~10^8 PFU/mL的噬菌體Φ199稀釋液，第1行到第4行加入50μL濃度分別為10^5、10^6、10^7和10^8 PFU/mL噬菌體，使每孔含200μL液體，具體加樣方式如圖1所示。
(圖1：噬菌體Φ199和鹽酸克林霉素體外聯(lián)合應用加樣示意)
同時設置陽性對照和陰性對照。隨后將96孔板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，使用酶標儀檢測每孔在600 nm處OD值，計算抗菌效率。公式如下：抗菌效率%=(對照組OD600 nm值-試驗組OD600 nm值)/對照組OD600 nm值。試驗重復3次取平均值。
2結(jié)果
2.1噬菌體Φ199及其噬菌斑的形態(tài)特征
如圖2A所示，噬菌體Φ199的噬菌斑形態(tài)為圓形，透亮的空斑，邊緣清晰，直徑約為2 mm。透射電鏡觀察顯示(圖2B)，噬菌體Φ199病毒顆粒頭部是直徑約為50 nm的二十面體，具有可以收縮的尾部，長度約為100 nm，屬于肌尾型噬菌體。
(圖2：A.噬菌體Φ199形成的噬菌斑形態(tài)；B.噬菌體Φ199負染后的電鏡圖(比例尺=50 nm))
2.2噬菌體Φ199最佳MOI
如圖3所示，噬菌體Φ199的效價在MOI為0.01~100時均能夠達到10^8 PFU/mL，并且在MOI為1時，噬菌體的滴度最高為9.24×10^8 PFU/mL，因此噬菌體Φ199與宿主菌O157:H7的最佳MOI為1。
(圖3：噬菌體Φ199的最佳MOI)
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