碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌聯(lián)合藥敏試驗(yàn)方法學(xué)、流程、優(yōu)缺點(diǎn)和結(jié)果判讀（二）
5聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果判讀
常用部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)IC）為判斷依據(jù)[18-19]，即①FIC≤0.5：協(xié)同作用，提示兩種藥物聯(lián)合后的抗菌活性顯著大于各單藥；②FIC＞0.5～1：相加作用，提示兩種藥物聯(lián)合后的抗菌活性較各單藥稍有增加；③FIC＞1～2：無關(guān)作用，提示兩種抗菌藥物的活性均不受另一種藥物的影響；④FIC＞2：拮抗作用，提示一種抗菌藥物的活性被另一種抗菌藥物削弱。
FIC指數(shù)計(jì)算公式：
專家共識(shí)三：在進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)前，應(yīng)先進(jìn)行單藥的藥敏試驗(yàn)，優(yōu)先選擇敏感的抗菌藥物進(jìn)行聯(lián)合，或以兩藥MIC值為中心，上下3～4個(gè)濃度進(jìn)行交叉聯(lián)合，開展聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。
6聯(lián)合藥敏試驗(yàn)方案推薦
由于不同種類的抗菌藥物對(duì)產(chǎn)生不同碳青霉烯酶菌株的體外抗菌活性不同，不同耐藥菌由于耐藥機(jī)制的差異導(dǎo)致其對(duì)抗菌藥物的敏感性不同。因此，應(yīng)根據(jù)不同的CRO菌株制定不同的抗感染治療方案。如頭孢他啶-阿維巴坦對(duì)于產(chǎn)KPC酶或OXA-48型酶腸桿菌目細(xì)菌具有高度抗菌活性，但對(duì)于產(chǎn)金屬酶菌株需聯(lián)合氨曲南；替加環(huán)素對(duì)碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌和鮑曼不動(dòng)桿菌具有高度抗菌活性，但對(duì)銅綠假單胞菌無抗菌活性；而多黏菌素（包括多黏菌素B和黏菌素）對(duì)上述三種耐藥菌均具有高度抗菌活性（天然耐藥菌株除外）。除此之外，磷霉素對(duì)腸桿菌目細(xì)菌具有較強(qiáng)抗菌活性，但對(duì)銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌基本無抗菌活性；阿米卡星對(duì)CRO菌株具有一定抗菌活性，需根據(jù)藥敏試驗(yàn)情況而定；而頭孢哌酮-舒巴坦（尤其是舒巴坦加大劑量）對(duì)于CRAB仍具有一定抗菌活性[22-23]。基于此，實(shí)驗(yàn)室在開展針對(duì)CRO菌株的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)時(shí)，需根據(jù)不同耐藥菌的特征而設(shè)計(jì)針對(duì)性的多藥聯(lián)合藥敏試驗(yàn)方案。
專家共識(shí)四：各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)本院CRO菌株耐藥機(jī)制，制定不同聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的抗菌藥物組合。
專家共識(shí)五：對(duì)于新β內(nèi)酰胺類抗生素-β內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑，如頭孢他啶-阿維巴坦、美羅培南-韋博巴坦和亞胺培南-瑞來巴坦等，若藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)該類復(fù)方制劑敏感，可直接用于敏感菌所致感染的治療，無需開展聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。
專家共識(shí)六：對(duì)于不同CRO菌株聯(lián)合藥敏試驗(yàn)抗菌藥物的選擇，應(yīng)參考臨床抗感染治療指南或?qū)＜夜沧R(shí)確定，具體參考表1[22-30]。
表1 CRO聯(lián)合藥敏試驗(yàn)抗菌藥物組合推薦
7聯(lián)合藥敏試驗(yàn)方法學(xué)簡介、優(yōu)缺點(diǎn)和結(jié)果判讀（表2）
表2不同聯(lián)合藥敏試驗(yàn)方法學(xué)簡介、結(jié)果報(bào)告、抗菌作用、優(yōu)缺點(diǎn)、結(jié)果判讀和推薦級(jí)別
7.1肉湯微量稀釋棋盤法
肉湯微量稀釋棋盤法[16-17]用于測定抗菌藥物抑制或殺滅微生物的最低濃度，通常以mg/L為單位。抗菌藥物A和抗菌藥物B經(jīng)倍比系列稀釋后，以不同濃度組合進(jìn)行混合，經(jīng)過孵育后閱讀單藥及兩藥聯(lián)合后的MIC。肉湯微量稀釋法使用的96孔微量板在最終接種完成后通常每孔中液體終體積為0.1 mL，細(xì)菌終濃度為5×105CFU/mL。作為參考方法，肉湯微量稀釋棋盤法可精確測定細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性，明確兩藥之間是否存在協(xié)同、相加、無關(guān)和拮抗作用（圖2和圖3）。但該方法比較耗時(shí)，工作量大且對(duì)方法學(xué)技術(shù)要求高，因此一般僅用于科學(xué)研究，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室通常較少開展。
圖2肉湯微量稀釋棋盤法協(xié)同、相加示意圖
圖3肉湯微量稀釋棋盤法無關(guān)、拮抗示意圖
7.2瓊脂稀釋棋盤法
瓊脂稀釋棋盤法[31]是將兩種抗菌藥物分別配制成單獨(dú)的不同濃度的溶液，之后以不同的兩藥藥物濃度組合加入到每一塊瓊脂平板中，配置成含抗菌藥物濃度成倍比系列稀釋的藥物平板。使用多點(diǎn)接種器將制備好的細(xì)菌菌懸液點(diǎn)種到瓊脂表面，經(jīng)35℃16～20 h培養(yǎng)后，肉眼觀察細(xì)菌生長，以未見細(xì)菌生長平板的最低藥物濃度為MIC（圖4）。其優(yōu)點(diǎn)是每個(gè)平板可同時(shí)測定多株細(xì)菌，可直接觀察受試菌生長是否良好或污染等。但該方法與肉湯微量稀釋棋盤法一樣比較耗時(shí)，工作量大且對(duì)方法學(xué)技術(shù)要求高，因此一般僅用于科學(xué)研究，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室通常較少開展。
圖4瓊脂稀釋棋盤法示意圖
7.3紙條法
紙條法[17，21，32-34]亦稱梯度擴(kuò)散法，所用材料名稱為E試驗(yàn)條（Epsilometer，E-test）和MIC測試條（MIC test strip，MTS），是一種商品化的定量測定細(xì)菌對(duì)抗菌藥物敏感性的方法。它結(jié)合了稀釋法和擴(kuò)散法的原理和特點(diǎn)，操作同紙片擴(kuò)散法一樣簡便易行，結(jié)果又如同稀釋法一樣，可獲得定量的MIC值，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好。紙條法包括兩種：①紙條優(yōu)加法，操作時(shí)在一塊已涂布菌液的MHA平板上貼上含抗菌藥物A和抗菌藥物B的紙條；在另一塊已涂布菌液的MHA平板上先貼上含抗菌藥物A的紙條，30 min后，待抗菌藥物A完全滲透入瓊脂中后移去紙條，再在相同的位置覆蓋貼上抗菌藥物B。過夜孵育后閱讀抗菌藥物A單藥、抗菌藥物B單藥以及抗菌藥物A和抗菌藥物B堆疊后的MIC（圖5）。②紙條交叉法：抗菌藥物A和抗菌藥物B紙條垂直交叉放置（單藥MIC處交叉，因此需提前測定單藥MIC），孵育后閱讀聯(lián)合后抗菌藥物A和抗菌藥物B的MIC，計(jì)算FIC指數(shù)，判斷兩藥是否存在協(xié)同、相加、無關(guān)和拮抗作用（圖6）。紙條法具有操作簡單的特點(diǎn)，且結(jié)果容易閱讀。
圖6紙條交叉法聯(lián)合藥敏試驗(yàn)
專家共識(shí)七：兩藥協(xié)同定義為該菌對(duì)抗菌藥物A和抗菌藥物B單藥均為耐藥，但抗菌藥物B在抗菌藥物A存在時(shí)表現(xiàn)為敏感或中介。
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