基于體外重組雞傳染性貧血病毒生長曲線來研究復(fù)制效率（三）
3討論
自1979年日本學(xué)者Yuasa等首次在日本分離到CIAV（Gifu-1株）以來，CIAV在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)快速蔓延趨勢，在全球多地區(qū)分布。我國于1992年首次于黑龍江報道該病并分離到該病毒。隨后，遼寧、江蘇、山東、廣東、廣西、安徽、江西以及臺灣等地也陸續(xù)報道了該病的流行。目前，CIAV在全國各省市、自治區(qū)流行態(tài)勢嚴(yán)峻，防控壓力日益增大。CIAV主要引起雛雞的再生障礙性貧血和全身性淋巴組織萎縮，成年雞感染CIAV后常呈亞臨床帶毒，生產(chǎn)性能以及免疫功能下降，增加對其他病原（如病毒、細菌、真菌）的易感性。CIAV感染往往可降低疫苗的免疫效果和增強弱毒活疫苗的致病力，從而造成免疫失敗。
同時，CIAV與其他一些病毒性疾病如J亞群禽白血病病毒（ALV-J）、馬立克病病毒（MDV）和FAdV-4等混合感染時會加重雞群疫病，引起更為嚴(yán)重的免疫抑制和更高的死亡率。此外，有研究報道，可能是接種污染了CIA的弱毒活疫苗，低致病性CIAV在國內(nèi)SPF雞群中同樣存在?，F(xiàn)階段，雖然CIA商品化弱毒活疫苗在種雞中使用較廣泛，如法國詩華動物保健公司生產(chǎn)的CIRCOMUNE®，默沙東公司生產(chǎn)的Nobilis®CAV P4，德國羅曼動物保健品公司以Cux-1毒株生產(chǎn)的弱毒活疫苗以及維奧（BIOVAC）生產(chǎn)的Gyrovac。但CIAV感染及其與其他病原的共感染在國內(nèi)雞群仍呈普遍性，很大程度上制約了國內(nèi)養(yǎng)雞業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。值得注意的是，CIA商品化弱毒活疫苗僅適用于種雞或6周齡以上雞的免疫，對2周齡以下雛雞存在潛在的感染風(fēng)險。雛雞感染CIAV弱毒后可導(dǎo)致免疫抑制，對其他疫苗造成免疫失敗。
此外，F(xiàn)ang等研究表明CpG ODN佐劑比Freund佐劑能更好地誘導(dǎo)CIAV特異性抗體反應(yīng)，是未來CIA亞單位疫苗佐劑的候選。Shen等研究表明重組病毒蛋白（rVP1）+鴿γ干擾素（rPiIFN-γ）疫苗可能是一種新的預(yù)防CIA的疫苗。
Tseng等證明桿狀病毒表達系統(tǒng)產(chǎn)生的自組裝病毒樣顆粒（VLP）同樣有可能成為一種安全有效的CIA疫苗。關(guān)于DNA疫苗，有研究報道通過使用表達CIAV的VP1和VP2蛋白的雙順反子載體來制備CIA DNA疫苗，CIAV的VP1蛋白與血清1型MDV的VP22蛋白融合可以提高CIA DNA疫苗的效力，大腸桿菌表達截短的高遷移率族框1（HMGB1）蛋白作為新型免疫佐劑可誘導(dǎo)CIAV保護性免疫應(yīng)答。但上述CIA亞單位疫苗和DNA疫苗皆無商品化應(yīng)用的報道。因此，創(chuàng)制新型CIA疫苗對高效免疫防控CIAV感染及其他病毒病至關(guān)重要。
近年來，國內(nèi)雞群除了CIAV感染具有普遍性外，F(xiàn)AdV感染的報道也逐年增多。其中，以高致病性FAdV-4導(dǎo)致的肝炎-心包積液綜合征在雞群最為流行，對國內(nèi)養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。本課題組前期在探究FAdV-4的Fiber蛋白介導(dǎo)的病毒感染與致病中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)iber-1直接介導(dǎo)FAdV-4感染，而Fiber-2為FAdV-4的重要致病因子。
進一步利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)發(fā)現(xiàn)Fiber-2不僅具有可編輯性，而且構(gòu)建的EGFP-Fiber-2融合，EGFP代替Fiber-2以及Fiber-2部分缺失的重組FAdV-4病毒能作為致弱的基因工程FAdV-4候選疫苗。
本研究整合CRISPR-Cas9和Cre-LoxP系統(tǒng)，以EGFP-Fiber-2融合的重組病毒FA4-EGFP為模板，將CIAV的保護性抗原基因VP1替換FAdV-4中的fiber-2基因，拯救出了表達CIAV的VP1蛋白的新型重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1。在該系統(tǒng)中，通過觀察RPF，可以直觀地在LMH細胞中發(fā)現(xiàn)含有外源基因的重組FAdV-4，與所使用的表達EGFP的模板病毒FA4-EGFP所區(qū)分。
通過有限稀釋和病毒空斑試驗，重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1-RFP可以得到快速純化。通過轉(zhuǎn)染Cre重組酶進一步去除重組FAdV-4-CIAV-VP1-RFP中的RFP表達盒，能夠非常高效地獲得重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1。雖然重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1可有效表達CIAV的VP1蛋白，但其在易感細胞LMH中的復(fù)制能力要顯著低于野生型FAdV-4。此外，文獻報道單獨的VP1蛋白并不能對雞提供有效保護。因此，構(gòu)建的重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1是否對雞高度致弱，是否可通過有效表達的VP1蛋白免疫防控CIAV或同時防控CIAV與FAdV-4尚需進一步通過動物試驗進行評估。
4結(jié)論
本研究成功構(gòu)建可有效表達VP1蛋白的新型重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1，在易感細胞LMH中的復(fù)制能力顯著低于野生型FAdV-4，為有效防控CIAV和FAdV-4感染提供新思路。