基于全細胞生長的 GAT 生長耦合策略，突破合成肌酸過程中的代謝瓶頸
肌酸是一種通過肌酸/磷酸肌酸系統在脊椎動物中作為能量儲存和緩沖系統的分子，其中磷酸基團通過酶促反應在ATP和肌酸之間轉移。該分子在肌肉發育和神經生理性能中發揮重要作用。人類內源性肌酸合成量（約1克/天）僅能滿足每日需求的一半（約2克/天），因此需要補充。然而，肌酸僅存在于動物性食物中，這突顯了植物性飲食中替代肌酸補充的重要性。目前市場上銷售的肌酸是通過化學合成生產，嚴重依賴于化石燃料基的原材料，成本較高。此外，由于殘留的氰胺衍生物可能導致食品污染，其去除過程會顯著增加下游工藝的成本。
近日，期刊《Metabolic Engineering》上發表了研究論文“Microbial production of creatine using growth-coupled selection systems”，使用表達異源途徑的大腸桿菌細胞工廠開發生物合成過程，作為一種化學合成的替代方案。并采用了一種基于模型的生長耦合選擇方法，結合適應性實驗室進化，以克服異源合成肌酸過程中的代謝瓶頸。
經過多次設計-構建-測試-學習的進化與選擇循環，與對照菌株相比，從甘氨酸和精氨酸合成的肌酸產量提高了58%。脊椎動物中肌酸由精氨酸和甘氨酸經兩步酶促反應合成，即甘氨酸脒基轉移酶（GAT）將兩者轉化為鳥氨酸和胍基乙酸（GAA），胍基乙酸甲基轉移酶（GAMT）利用輔因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將GAA甲基化生成肌酸。研究團隊在大腸桿菌中組裝了該途徑，篩選并密碼子優化了8種GAT和4種GAMT酶，發現GAT8與GAMT4組合的生產效果最佳。
在該研究中，甘氨酸脒基轉移酶（GAT）是肌酸生物合成途徑的關鍵限速酶，研究團隊通過兩種生長耦合策略對其進行優化，核心內容如下：設計1：基于全細胞生長的GAT生長耦合策略設計思路該策略旨在通過代謝網絡重構，將GAT的催化活性與大腸桿菌的生長直接關聯——即GAT活性越高，細胞生長越好，從而實現高效篩選。具體設計基于基因組尺度代謝模型：
·讓精氨酸和甘氨酸作為唯一碳源，GAT催化二者生成鳥氨酸；
·通過異源表達鳥氨酸環脫氨酶（OCD），將鳥氨酸轉化為脯氨酸，而脯氨酸作為碳源和能量來源參與生物量合成；
·敲除可能繞過GAT反應的替代途徑，確保GAT活性是鳥氨酸生成的唯一途徑，進而成為生長必需條件。
實驗挑戰與失敗原因
·OCD活性不足：初始使用的OCD突變體（OCDv1）催化效率低，無法將鳥氨酸有效轉化為脯氨酸，導致細胞在鳥氨酸作為碳源時無法生長；通過適應性實驗室進化仍未解決核心問題。
·精氨酸對OCD的抑制：精氨酸與鳥氨酸分子結構相似，會競爭性結合OCD的活性位點，抑制其催化功能。當精氨酸濃度較高時，OCD幾乎失活，導致GAT與生長的耦合關系斷裂，最終該設計失敗。
設計2：基于脯氨酸營養缺陷的GAT生長耦合策略（優化后）設計思路由于設計1中“全生物量生長耦合”對GAT活性要求過高，且受精氨酸抑制影響顯著，團隊改為“弱耦合”策略——僅將GAT活性與細胞對脯氨酸的基礎需求關聯，降低代謝負擔：
·敲除脯氨酸合成基因（ΔproB），使細胞成為脯氨酸營養缺陷型，必須依賴外源脯氨酸或通過鳥氨酸轉化獲取；
·同時敲除鳥氨酸內源合成基因（ΔargA），確保鳥氨酸只能通過GAT催化精氨酸和甘氨酸生成，進而轉化為脯氨酸滿足生長需求；
·該設計大幅降低了對GAT的通量要求，且通過調控精氨酸濃度可避免OCD抑制，使GAT活性與生長的耦合關系穩定。篩選結果通過該策略對GAT隨機突變庫進行篩選，獲得3種高效GAT變體（GAT8_v1、v2、v3）：
·這些變體的突變位點集中在預測的α螺旋和底物結合口袋，可能通過改變蛋白結構增強催化效率；與野生型GAT8相比，其胍基乙酸（GAA，肌酸直接前體）產量提升73%-94%，最終使肌酸產量較基準菌株提高58%，達到100 mg/L以上。
隨后，作者發現胞內肌酸積累會抑制大腸桿菌生長，通過適應性實驗室進化（ALE），在逐步提高胍基乙酸（GAA）濃度的條件下進化菌株，獲得的耐受菌株與優化的GAT變體結合后，肌酸產量較基準菌株提升58%，達到100 mg/L以上。該研究成功在大腸桿菌中重構了肌酸生物合成途徑，通過生長耦合選擇系統與適應性實驗室進化結合，克服了代謝瓶頸和產物毒性問題，為替代化學合成、實現肌酸可持續生產奠定了基礎，也為生物制造中生長耦合生產系統的開發提供了參考。
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