基于機(jī)制的藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)模型預(yù)測(cè)大腸桿菌和不同環(huán)丙沙星濃度的細(xì)菌殺滅時(shí)間
研究背景：由于過(guò)度使用和濫用抗生素而導(dǎo)致的日益嚴(yán)重的抗生素耐藥性問(wèn)題正威脅著我們回到抗生素前時(shí)代。在治療期間對(duì)抗現(xiàn)有耐藥性和限制耐藥性細(xì)菌的富集時(shí)，必須了解常見耐藥性突變與暴露于抗生素時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)和死亡的時(shí)間曲線之間的關(guān)系。已經(jīng)針對(duì)不同的細(xì)菌菌株和抗生素開發(fā)了計(jì)算機(jī)PK/PD模型。但是模型的目標(biāo)可能不同。例如，一些模型側(cè)重于根據(jù)數(shù)據(jù)評(píng)估基于機(jī)制的理論，而一些模型更側(cè)重于提高藥物開發(fā)效率，例如，基于有限的新信息預(yù)測(cè)未研究的結(jié)果或在存在不太敏感的細(xì)菌的情況下對(duì)不同給藥方案的預(yù)測(cè)。在這項(xiàng)研究中，研究人員進(jìn)一步開發(fā)了Nielsen模型，用于研究暴露于氟喹諾酮的大腸桿菌。氟喹諾酮類藥物是一類重要的抗生素，通常用于對(duì)抗革蘭氏陰性菌感染。環(huán)丙沙星是一種氟喹諾酮類藥物，通過(guò)抑制DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV發(fā)揮作用，從而抑制細(xì)胞分裂和細(xì)菌死亡。大腸桿菌中導(dǎo)致環(huán)丙沙星耐藥的常見突變包括gyrA1、gyrA2（DNA促旋酶）、parC中的突變（拓?fù)洚悩?gòu)酶IV）和marR（外排系統(tǒng)AcrAB的阻遏物）。與WT相比，這些突變通常與更高的MIC值相關(guān)，并且還可能降低細(xì)菌適應(yīng)度。這些突變?nèi)绾斡绊懨枋鯬K/PD關(guān)系的參數(shù)以及因此藥物暴露后細(xì)菌殺滅的時(shí)間過(guò)程是令人感興趣的，因?yàn)檫@些信息可以為未來(lái)研究的設(shè)計(jì)和給藥方案的開發(fā)提供有價(jià)值的信息。本研究的目的是開發(fā)一種基于機(jī)制的計(jì)算機(jī)模型，該模型可以描述大腸桿菌MG1655 WT和暴露于環(huán)丙沙星的六種同基因突變體的體外時(shí)間殺傷實(shí)驗(yàn)，并確定可用于在類似環(huán)境中簡(jiǎn)化未來(lái)表征的關(guān)系.研究了特定突變對(duì)描述不同環(huán)丙沙星濃度的細(xì)菌殺滅時(shí)間過(guò)程的模型參數(shù)的影響，并開發(fā)了一個(gè)通用的PK/PD模型結(jié)構(gòu)。
丹麥Biosense微生物生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用
使用oCelloScope微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)0.5x MIC下的細(xì)胞隨時(shí)間的變化形態(tài)。在預(yù)熱的MHII肉湯中制備細(xì)菌接種物，不同之處在于第二次稀釋以1:50進(jìn)行，以進(jìn)一步1:2稀釋到微量滴定板（帶蓋的96孔微量滴定板)已經(jīng)含有100μL MHII和不同濃度的環(huán)丙沙星。通過(guò)放大最佳聚焦部分并導(dǎo)出到位圖來(lái)選擇具有代表性的絲狀圖像。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
開發(fā)一種基于機(jī)制的計(jì)算機(jī)模型，該模型可以描述大腸桿菌MG1655 WT和暴露于環(huán)丙沙星的六種同基因突變體的體外時(shí)間殺傷實(shí)驗(yàn)，并確定可用于在類似環(huán)境中簡(jiǎn)化未來(lái)表征的關(guān)系.研究了特定突變對(duì)描述不同環(huán)丙沙星濃度的細(xì)菌殺滅時(shí)間過(guò)程的模型參數(shù)的影響，并開發(fā)了一個(gè)通用的PK/PD模型結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)模型衍生的突變體特異性EC 50估計(jì)值與實(shí)驗(yàn)確定的MIC高度相關(guān)(r 2=0.99)，這意味著突變菌株的體外時(shí)間-殺傷曲線可以通過(guò)僅基于模型的MIC合理地很好地預(yù)測(cè)。開發(fā)的模型包括易感生長(zhǎng)細(xì)菌、較不敏感（預(yù)先存在的抗性）生長(zhǎng)細(xì)菌、非易感非生長(zhǎng)細(xì)菌和非菌落形成非生長(zhǎng)細(xì)菌。非菌落形成狀態(tài)可能是由于細(xì)絲的形成，需要描述接近MIC的數(shù)據(jù)。每種菌株具有不同殺滅細(xì)菌效力(EC50)的通用模型結(jié)構(gòu)成功地表征了WT和六種大腸桿菌突變體的時(shí)間-殺滅曲線。
圖1、突變菌株，與LM347相比的相對(duì)適應(yīng)度，并測(cè)量了實(shí)驗(yàn)中使用的不同大腸桿菌MG1655菌株的MIC，本實(shí)驗(yàn)中確定了WT細(xì)菌和其中一種突變體的MIC。
圖2、用于大腸桿菌MG1655 WT的VPC及其六個(gè)充分表征的突變體。(a)模型擬合完整模型和(b)模型擬合EC50/MIC相關(guān)模型。每個(gè)面板包括所有觀察結(jié)果(o)，即至少三個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)，所有可檢測(cè)細(xì)菌的稀釋度，黑色實(shí)線代表模擬中值。灰色虛線下方的觀測(cè)值是LOD下方的觀測(cè)值，并繪制為0.15×LOD(1.5)。對(duì)最終模型進(jìn)行了1000次模擬，以構(gòu)建80%的預(yù)測(cè)區(qū)間，代表估計(jì)的和預(yù)期的實(shí)驗(yàn)變異性。
圖3、為環(huán)丙沙星和大腸桿菌MG1655 WT以及暴露于環(huán)丙沙星的六種充分表征的突變體開發(fā)的基于機(jī)制的PK/PD模型。S1、易感菌；R1，靜息/不敏感，不生長(zhǎng)的細(xì)菌；Nc1，亞群1的非菌落形成細(xì)菌。亞群2代表預(yù)先存在的抗性細(xì)菌（S2、R2和Nc2）。
圖4、由完整模型估計(jì)的EC 50與通過(guò)宏觀稀釋實(shí)驗(yàn)確定的MIC。對(duì)于具有共享E max和k生長(zhǎng)參數(shù)的最終模型，不同菌株的估計(jì)EC 50值與實(shí)驗(yàn)測(cè)量的MIC高度相關(guān)，r 2=0.99。
圖5、(a)菌株LM347的熒光激活細(xì)胞分選結(jié)果，在y軸上具有相對(duì)細(xì)菌密度，在x軸上對(duì)應(yīng)于顆粒（細(xì)菌）的大小的前向散射光高度（FSC-H）。(b)oCelloScope微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)獲得的圖像顯示LM347菌株在0.5倍環(huán)丙沙星MIC下24小時(shí)內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)。從圖b中可以看出使用oCelloScope在24小時(shí)內(nèi)研究了0.5×MIC下的細(xì)胞形態(tài)，并觀察到更長(zhǎng)的大腸桿菌鏈表明絲狀化）。
總結(jié)
本研究開發(fā)了一個(gè)基于機(jī)制的藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)（PK/PD）模型，用于預(yù)測(cè)環(huán)丙沙星對(duì)大腸桿菌MG1655野生型（WT）及其六個(gè)同源突變體的殺傷力。這些突變體包含一到四個(gè)與臨床耐藥性相關(guān)的突變。研究的目的是建立一個(gè)模型，能夠根據(jù)體外時(shí)間致死實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)抗生素的最佳劑量策略，以提高治療效果并限制耐藥性的產(chǎn)生。研究中WT和突變體暴露于不同濃度的環(huán)丙沙星，通過(guò)時(shí)間殺死實(shí)驗(yàn)收集數(shù)據(jù)。Biosense微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（oCelloScope）被用于監(jiān)測(cè)和分析大腸桿菌在暴露于環(huán)丙沙星后的細(xì)胞形態(tài)變化。Biosense微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（oCelloScope）在本研究中作為一種重要的實(shí)驗(yàn)工具，提供了關(guān)于細(xì)菌形態(tài)變化的直觀證據(jù)，這些證據(jù)對(duì)于理解細(xì)菌對(duì)抗生素的響應(yīng)、構(gòu)建和驗(yàn)證PK/PD模型以及預(yù)測(cè)抗生素的殺傷力具有重要作用。建立的模型包括易感生長(zhǎng)細(xì)菌、較低易感生長(zhǎng)細(xì)菌、非易感非生長(zhǎng)細(xì)菌和非形成菌落的非生長(zhǎng)細(xì)菌。模型成功描述了WT和突變體的時(shí)間殺滅曲線，并顯示出突變體特異性的EC50（抗生素濃度達(dá)到最大殺滅率50%的值）與實(shí)驗(yàn)測(cè)定的MIC高度相關(guān)（r2=0.99），表明可以通過(guò)MIC值預(yù)測(cè)突變體菌株的體外時(shí)間殺死曲線。研究結(jié)果表明，該模型能夠預(yù)測(cè)不同大腸桿菌菌株的體外時(shí)間殺死曲線，對(duì)于指導(dǎo)藥物研發(fā)和優(yōu)化給藥方案具有潛在價(jià)值。此外，模型的建立為預(yù)測(cè)患者群體中的改進(jìn)劑量策略提供了可能，有助于有效治療由WT和耐藥大腸桿菌引起的感染。研究的局限性包括未涉及傳統(tǒng)靜態(tài)體外時(shí)間殺滅條件之外的數(shù)據(jù)，以及研究的菌株除了耐藥性突變外都是同源的，沒(méi)有包括臨床分離的大腸桿菌。未來(lái)的研究需要針對(duì)不同的大腸桿菌菌株和其他實(shí)驗(yàn)條件對(duì)模型的預(yù)測(cè)能力進(jìn)行評(píng)估，以更好地了解其在藥物開發(fā)中的實(shí)用性。
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