豬鼻支原體菌液活菌不同濃度與pH值下生長曲線的變化
支原體污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見和棘手的污染源，培養(yǎng)法是支原體檢驗的常用方法[1-3]。國內(nèi)已有通過生長滴度測定法，獲得牛支原體OF2株、山羊支原體山羊肺炎亞種分離株M1601在不同培養(yǎng)基中生長曲線的報道[4-5]，也有人通過活菌計數(shù)測定法獲得人型支原體(Mh)生長曲線[6]。測定不同時刻牛支原體的OD值和pH，亦可繪制該株牛支原體的生長曲線，但只能是在一定程度上反映生長趨勢，而無法進(jìn)行計量描述，有一定局限性[7]。
豬鼻支原體(CVCC361)作為支原體液體培養(yǎng)基和支原體固體培養(yǎng)基的質(zhì)控菌株[8]，其生長曲線于2012年被國內(nèi)學(xué)者繪制完成，但就培養(yǎng)基質(zhì)控菌株的標(biāo)準(zhǔn)化工作而言，其傳代次數(shù)、菌液接種適宜比例、生長滴度變化等還需進(jìn)一步考證[9]。為彌補(bǔ)這一研究空缺，本試驗就豬鼻支原體菌液活菌濃度與pH值變化關(guān)系以及適宜傳代代次等進(jìn)行了研究，旨在為支原體液體培養(yǎng)基和支原體固體培養(yǎng)基的質(zhì)控工作的標(biāo)準(zhǔn)化提供參考。
不同接種濃度和收獲時間差異比較
不同接種濃度活菌濃度和pH值的比較兩種濃度接種的豬鼻支原體各時間點的活菌濃度和pH值如表1和表2所示。從表1可以看出，3%濃度接種的豬鼻支原體0～48 h活菌濃度持續(xù)上升，到48 h達(dá)到峰值13.1×108CFU/mL，菌液pH值則持續(xù)下降，在40～48 h之間某時刻降至7.0以下。從表2可以看出，10%濃度接種的豬鼻支原體0～48 h活菌濃度持續(xù)上升，到48 h達(dá)到峰值14.0×108CFU/mL，菌液pH值則持續(xù)下降，在30～48 h之間某時刻降至7.0以下。
生長曲線兩種接種濃度豬鼻支原體生長曲線見圖1和圖2。從圖1可以看出，以3%濃度接種，豬鼻支原體在0～48 h活菌濃度平穩(wěn)上升，生長速率逐漸升高。以10%濃度接種，豬鼻支原體在0～48 h活菌濃度持續(xù)上升，0～6 h為遲緩期，6～48 h為對數(shù)期，其中24～30 h生長速率最快。從圖2可以看出，0～48 h內(nèi)，兩種濃度接種菌液pH值變化范圍和趨勢大致相同，變化范圍為6.63～7.55。3%濃度接種，0～16 h內(nèi)，pH值下降平緩，16～48 h pH值下降速度較快。10%濃度接種，0～6 h內(nèi)，pH值下降平緩，6～48 h pH值下降速度較快，且10%比3%pH值下降更快。
圖1不同接種比例豬鼻支原體生長曲線
圖2不同接種比例豬鼻支原體pH值變化
1～5代菌活菌計數(shù)結(jié)果活菌計數(shù)結(jié)果見表3。各代次間活菌濃度進(jìn)行差異分析結(jié)果見表4，F(xiàn)=1.67
不同傳代體積差異比較從表5可以看出兩種傳代體積豬鼻支原體不同生長情況，“0.3 mL菌液加入9.7 mL培養(yǎng)基”這種體積構(gòu)成的傳代方式下，20組菌液濃度平均值為24.4×108CFU/mL，標(biāo)準(zhǔn)差5.7；“0.9 mL菌液加入29.1 mL培養(yǎng)基”這種體積構(gòu)成的傳代方式下，20組菌液濃度平均值為7.2×108CFU/mL，標(biāo)準(zhǔn)差2.1；用雙樣本異方差假設(shè)下t檢驗對這兩組實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩種傳代方式下活菌濃度之間差異極顯著。
表5不同傳代體積豬鼻支原體活菌濃度
**表示差異極顯著
討論與小結(jié)
本試驗通過活菌計數(shù)和pH值測定，首次確定了豬鼻支原體適宜傳代比例、收獲時間、菌種代次以及傳代體積。
傳代比例傳代比例是微生物傳代過程中一項重要的技術(shù)參數(shù)，劉軼秋等曾將3%作為支原體液體培養(yǎng)基質(zhì)控菌豬鼻支原體的傳代比例[9]，而在日常檢驗中，常用的比例是10%，通過比較，10%接種傳代的菌，前期生長較快，而3%接種傳代的菌后期生長較快，兩種濃度傳代的菌濃度最后趨于統(tǒng)一。以3%比例傳代，豬鼻支原體初始數(shù)量相對較少，培養(yǎng)基體積相對較多，單位數(shù)量豬鼻支原體獲得的營養(yǎng)也更加豐富，更利于生長。另外，豬鼻支原體在培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)生的酸性物質(zhì)使pH值下降，而支原體這類微生物對生長環(huán)境的酸堿度有嚴(yán)格要求，pH值低于7的環(huán)境則會造成其生長抑制或死亡[2]，有報道發(fā)現(xiàn)，在液體培養(yǎng)基中，pH改變和肺炎支原體生長有密切關(guān)聯(lián)，pH接近6時達(dá)到最大菌濃度，pH降至5.2時肺炎支原體迅速死亡[11]。在3%比例傳代下，菌液pH值下降相對較慢，以這種比例傳代，對豬鼻支原體的生長亦是一種保護(hù)，通過上述分析，較之10%，3%更適于作為培養(yǎng)基日常檢驗中的傳代比例。
菌種最佳收獲時間結(jié)合豬鼻支原體的生長曲線和pH值變化來看，豬鼻支原體傳代后16～48 h內(nèi)活菌濃度達(dá)(4.6～13.1)×108CFU/mL，在這個時間段內(nèi)收獲菌液均可，但考慮到豬鼻支原體對低pH值的敏感性，故應(yīng)根據(jù)每次傳代接種情況的不同，在保證菌種充分生長的前提下，在菌液明顯變黃(pH<7)前收獲。
菌種代次按照《中國獸藥典》二〇一〇年版規(guī)定支原體液體培養(yǎng)基質(zhì)控菌豬鼻支原體傳代不可超過5代[8]，故本次實驗只對照1～5代菌。通過比較各代次菌在相同溫度下，培養(yǎng)相同時間后的活菌濃度，判斷出各代次菌之間生長差異。通過統(tǒng)計學(xué)方法分析，1～5代菌活菌濃度之間無顯著差異，在培養(yǎng)基檢驗工作中，為使培養(yǎng)基質(zhì)控菌均一、穩(wěn)定、活性強(qiáng)，可將1～5代菌作為質(zhì)控菌工作菌液。
傳代體積豬鼻支原體兼性厭氧，且一般需要5%～10%CO2生長環(huán)境[2]，在封閉的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基和菌液混合體體積較小，氧氣二氧化碳等氣體體積相對較大，小體積培養(yǎng)相對于大體積培養(yǎng)，優(yōu)勢在于氣體更多。從本次試驗結(jié)果來看，同為3%傳代比例下，“0.3 mL菌液+9.7 mL培養(yǎng)基”這種小體積的傳代方式比“0.9 mL菌液+29.1 mL培養(yǎng)基”這種大體積的傳代方式更利于豬鼻支原體生長，前者收獲時菌液濃度約為后者菌液濃度3倍，差異極顯著，說明在相對封閉的空間中，小體積培養(yǎng)模式更利于豬鼻支原體生長。通過上述分析可知，較之于“0.9 mL菌液+29.1 mL培養(yǎng)基”，將0.3 mL菌液加入9.7 mL培養(yǎng)基這種傳代方式更利于豬鼻支原體生長。
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