Biosense微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)應(yīng)用：研究黑曲霉分生孢子混合物萌發(fā)的方法
曲霉菌屬常見于食品中。例如，黑曲霉可以從大多數(shù)儲存的商品中分離出來，而構(gòu)巢曲霉、土曲霉和棒曲霉則可以在谷物和谷物產(chǎn)品中找到，曲霉菌也可能導(dǎo)致食物腐敗。食品被曲霉分生孢子污染或接種。這些無性孢子大量產(chǎn)生，并通過風(fēng)、水和昆蟲等動物傳播。休眠分生孢子的代謝活性較低，并且能夠抵抗干旱、高溫和低溫、高鹽、活性氧和紫外線等各種脅迫。食品基質(zhì)中分生孢子的萌發(fā)包括活化、膨脹、細(xì)胞極性的建立和芽管的形成。膨脹和芽管形成階段可以分別通過孢子體積的增加和圓形度的降低來區(qū)分。曲霉孢子的萌發(fā)受到各種環(huán)境因素的影響，包括溫度、可用水量、光照、pH和CO2。當(dāng)暴露于不同的營養(yǎng)條件時，不同曲霉的分生孢子具有不同的萌發(fā)動態(tài)。因此，當(dāng)與其他曲霉一起在不同的培養(yǎng)基中生長時，曲霉屬物種具有不同的競爭潛力。孢子密度也會影響曲霉菌的發(fā)芽率。增加黑曲霉或煙曲霉的孢子濃度會導(dǎo)致發(fā)芽率降低。然而迄今為止，尚未評估孢子密度對混合物種培養(yǎng)物中曲霉孢子萌發(fā)動態(tài)的影響。研究人員使用Biosense微生物生長動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)開發(fā)出一種研究孢子混合物萌發(fā)的方法。研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉分生孢子的萌發(fā)不僅受到其自身孢子密度的影響，而且還受到其他曲霉孢子密度的影響。這種效應(yīng)有助于后續(xù)了解自然界中真菌的生長，但也可能為防止食品腐敗、優(yōu)化食品發(fā)酵過程以及在使用曲霉作為細(xì)胞工廠時生產(chǎn)酶和小分子提供線索。
丹麥Biosense微生物生長動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)的應(yīng)用
使用oCelloScope設(shè)備觀察黑曲霉孢子的生長過程及對共培養(yǎng)物中黑曲霉孢子的鑒定。當(dāng)黑曲霉的分生孢子與另一種曲霉菌混合存在時，可以通過oCelloScope分析進行區(qū)分。在t=1小時確定不同分生孢子的圓形度、表面積和對比度的差異。不同曲霉屬物種的孢子圓形度之間沒有可檢測到的差異。萌發(fā)分析通過對oCelloScope設(shè)備進行觀察分析。該設(shè)備在24小時內(nèi)，每小時掃描總掃描長度≥405μm的最大數(shù)量1000個孢子。接種后1小時開始掃描，直到分生孢子沉降在板的底部。在t=1時手動去除鄰近或聚集的孢子，以獲得每個40-700像素（一個像素約為0.55×0.55μm）的物體區(qū)域一個分生孢子。使用時間間隔t=1到t=24內(nèi)每個物體（每個孢子都有自己的物體ID）的圓形度和表面積作為輸入，通過自定義R腳本將物體分類為靜止分生孢子、腫脹分生孢子和萌發(fā)分生孢子。
實驗結(jié)論
在大多數(shù)情況下，其他曲霉的孢子對腫脹和芽管形成的抑制作用比黑曲霉本身的密度更高。與黑曲霉相比，米曲霉、棒曲霉和構(gòu)巢曲霉對精氨酸的發(fā)芽反應(yīng)較高，而土曲霉則表現(xiàn)出較低的反應(yīng)。在脯氨酸的情況下觀察到類似的效果。與較高的黑曲霉密度相比，初級和/或次級代謝物的釋放可能是其他曲霉存在更強的發(fā)芽抑制的原因。在丙氨酸和脯氨酸的情況下，這些化合物應(yīng)該由休眠孢子釋放，因為在這些氨基酸存在的情況下，它們通常不會比黑曲霉更快地發(fā)芽。相比之下，米曲霉、棒曲霉和構(gòu)巢曲霉的幼體也可能在精氨酸中釋放這些代謝物，因為它們確實對這種氨基酸表現(xiàn)出更高的發(fā)芽反應(yīng)。在單一培養(yǎng)物和共培養(yǎng)物的孵育期間，培養(yǎng)基中的氨基酸濃度沒有變化。競爭性曲霉對這種碳源和氮源的吸收并不能解釋其他曲霉對黑曲霉萌發(fā)的強烈抑制作用。可能可以通過O2或CO2的競爭來解釋。
圖1、描述低密度（5000個孢子）和高密度（40000個）單一培養(yǎng)中黑曲霉分生孢子的膨脹和芽管形成的不對稱模型的參數(shù)估計。P max、τ和d分別代表分生孢子膨脹或萌發(fā)的最大百分比、P=0.5 P max時的時間以及萌發(fā)反應(yīng)的異質(zhì)性程度。括號之間表示置信區(qū)間，N代表t=1 h時的對象數(shù)量，而M代表由于菌絲變得太長或該對象被其他對象的菌絲遮擋而不再檢測到的對象數(shù)量。
圖2、黑曲霉分生孢子在低密度（5000個孢子；以藍色表示）和高密度（40,000個孢子；以紅色表示）時丙氨酸(A)、脯氨酸(B)、和精氨酸（C）監(jiān)測黑曲霉分生孢子的膨脹和芽管形成。圖2A說明丙氨酸溶脹的Pmax在低密度（93.28%）下顯著高于高密度（76.71%），但它們的τ相似（分別為5.27 h和5.43 h）。誘導(dǎo)氨基酸丙氨酸和脯氨酸存在的情況下，較高的黑曲霉孢子密度降低了腫脹和芽管形成的發(fā)生率，而這些氨基酸即使有影響，也不會高度影響腫脹和芽管的速率形成。
圖3、黑曲霉(A)、土曲霉(B)、米曲霉(C)、棒曲霉(D)和構(gòu)巢曲霉(E)的分生孢子圖像以及面積和對比度散點圖t=1小時時的曲霉分生孢子(F)。F中每個物種的樣本量≥1200個分生孢子。
圖4、黑曲霉和土曲霉(A)、構(gòu)巢曲霉(B)、棒曲霉(C)和米曲霉(D)孢子的模擬共培養(yǎng)。淺色（歐幾拉德距離分?jǐn)?shù)50-90）和深色（歐幾拉德距離分?jǐn)?shù)>90）藍點代表不與其他曲霉菌種群重疊的黑曲霉孢子。選擇深藍色點用于分析腫脹和芽管形成。黑點（歐氏距離分?jǐn)?shù)<50）代表重疊，而紅點（歐氏距離分?jǐn)?shù)≥50）代表不屬于重疊部分的其他曲霉菌的孢子。
圖5、使用生物三次重復(fù)培養(yǎng)低（藍線）和高（紅線）黑曲霉孢子密度2天期間培養(yǎng)基中丙氨酸(A)、脯氨酸(B)和精氨酸(C)的濃度。誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。黑線代表黑曲霉分生孢子與米曲霉孢子的共培養(yǎng)。
總結(jié)
曲霉菌可以用來生產(chǎn)食物，但也會使食物變質(zhì)。食品生產(chǎn)和腐敗都是由這些真菌的分生孢子萌發(fā)引起的，這些真菌的分生孢子分別是通過接種和污染引入的。這些孢子的萌發(fā)包括激活、膨脹、細(xì)胞極性的建立和芽管的形成。到目前為止，僅進行了真菌孢子的定量單物種萌發(fā)研究。研究人員對單一培養(yǎng)物或與其他食品相關(guān)曲霉（構(gòu)巢曲霉、土曲霉、棒曲霉和米曲霉）混合時食品腐敗真菌黑曲霉的孢子萌發(fā)進行了定量研究。在存在發(fā)芽誘導(dǎo)氨基酸脯氨酸或丙氨酸的情況下，但在低誘導(dǎo)氨基酸精氨酸的情況下，當(dāng)將35,000個額外的黑曲霉分生孢子添加到含有5000個的孔中時，腫脹和芽管形成的發(fā)生率降低。這些孢。在精氨酸存在的情況下，添加另一種曲霉的35,000個孢子對發(fā)芽也沒有影響，但與添加丙氨酸的情況下額外的黑曲霉孢子相比，發(fā)芽抑制作用更強。脯氨酸也獲得了類似的效果。結(jié)果表明，在有利的營養(yǎng)條件下，黑曲霉分生孢子的萌發(fā)受到其自身孢子密度和其他曲霉孢子密度的影響。這些結(jié)果增加了我們對真菌引起的食品腐敗的理解，并可用于優(yōu)化真菌食品生產(chǎn)。
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