不同溫度和pH對(duì)白三葉草鏈格孢菌菌落生長(zhǎng)的影響【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
白三葉草（Trifolium repens Linn.），中文異名白車軸草、白花苜蓿、白花車軸草、荷蘭翹搖等，為豆科蝶形花亞科三葉草屬多年生牧草。其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值好，柔嫩多汁，適口性好，產(chǎn)草量高，可作家畜、家禽的優(yōu)質(zhì)飼料和綠肥。同時(shí)因其生長(zhǎng)力強(qiáng)，繁殖容易，綠色期長(zhǎng)，耐踐踏，被廣泛應(yīng)用于城市綠化建設(shè)，是優(yōu)良的綠化觀賞草坪種。
鏈格孢菌屬半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗色孢科、鏈格孢屬，全世界已經(jīng)描述的約有500種，其中90%以上的種是兼性寄生于不同科的植物上，可引起多種葉斑病，常稱為黑斑病。周曉燕報(bào)道的白三葉草黑斑病的病原有兩種，一種為三葉草黑斑菌，屬子囊菌亞門、座囊菌目、座囊菌科、黑斑座囊菌屬，無(wú)性世代為三葉草黑斑集梗，屬半知菌亞門、叢梗孢目、集梗屈頂霉屬。另一種為三葉草多孢小球殼菌，屬子囊菌亞門、座囊菌目、座囊菌科、多孢小球殼菌屬。李晶等報(bào)道，鏈格孢菌為安徽銅陵銅尾礦區(qū)的優(yōu)勢(shì)植物白車軸草葉斑病的主要致病菌。白三葉草鏈格孢菌主要危害葉片、葉柄，通常為小而密集的黑色或?yàn)鹾谏“?，近圓形或不規(guī)則形，環(huán)境干燥時(shí)葉片枯黃早衰，嚴(yán)重影響白三葉草的應(yīng)用價(jià)值和觀賞性。筆者于2014年在甘肅農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室研究了溫度和pH對(duì)白三葉草鏈格孢菌菌落生長(zhǎng)的影響，以期為防治白三葉草鏈格孢菌提供參考。
1材料與方法
1.1供試材料
供試白三葉草葉片采自湖北省武漢市。PDA培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL。主要儀器為超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，生物顯微鏡。
1.2病原菌的分離培養(yǎng)
選擇具有典型癥狀的白三葉草葉片，洗凈，晾干，取新鮮病斑病健交界部分，剪取邊長(zhǎng)4～5 mm的病組織數(shù)塊，置于滅菌小容器內(nèi)，用70%酒精漂洗2～3 s，然后用0.1%升汞溶液消毒1～2 min，再經(jīng)無(wú)菌水漂洗3～4次，然后用滅菌的濾紙吸干水分。最后將病組織放到平板培養(yǎng)基上，25℃下進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后檢查分離、鏡檢、轉(zhuǎn)管、純化。
1.3柯赫氏法則印證
選取白三葉草健康的葉片，進(jìn)行表面消毒，放在底層鋪有吸水紙的搪瓷盤中，將純化后的菌絲接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d（圖1）。在菌落邊緣用打孔器打取直徑5 mm的菌餅接種在離體葉片上，以接種無(wú)菌的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照。25℃恒溫下保濕培養(yǎng)。觀察并記載發(fā)病情況，將發(fā)病葉片的病原菌再分離純化并進(jìn)行鏡檢。
1.4不同溫度下菌絲生長(zhǎng)觀察
設(shè)15、20、25、30、35、40℃6個(gè)溫度處理，每處理3個(gè)重復(fù)。在培養(yǎng)7 d的菌落邊緣用打孔器打取直徑5 mm的菌餅，接種在不同處理培養(yǎng)基上，按設(shè)置溫度恒溫培養(yǎng)，7 d后觀察記載菌落生長(zhǎng)情況。
1.5不同處理pH菌絲生長(zhǎng)觀察
用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)PDA培養(yǎng)基的pH至5、6、7、8、9。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。在培養(yǎng)7 d的菌落邊緣用打孔器打取直徑5 mm的菌餅，接種在不同pH培養(yǎng)基上，25℃下恒溫培養(yǎng)，7 d后觀察記載菌落生長(zhǎng)情況。
2結(jié)果與分析
2.1病原菌鑒定
如圖2所示，在PDA培養(yǎng)基上菌落圓形，中部黃褐色至黑色，邊緣為乳白色，短絨狀。從圖3看出，分生孢子梗褐色至暗褐色，分支或不分支，有隔。分生孢子棒狀或倒棒狀，暗褐色，0～3個(gè)縱隔，1～6個(gè)橫隔。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，鑒定該病原菌為半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗色孢科、鏈格孢屬真菌。
2.2溫度對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響
從表1可以看出，PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，25℃處理下菌落生長(zhǎng)最快，平均直徑為7.1 cm；其次是20℃處理，平均直徑為5.6 cm。35℃處理下菌落生長(zhǎng)最慢，平均直徑為1.9 cm。40℃處理下平均直徑大于35℃處理的平均直徑，這可能跟實(shí)驗(yàn)誤差有關(guān)。對(duì)菌落直徑進(jìn)行方差分析的結(jié)果表明，不同的溫度條件對(duì)鏈格孢菌的生長(zhǎng)有顯著影響，其中25℃條件下與其余溫度條件下各處理差異極顯著；溫度過(guò)低（15℃）或過(guò)高（35℃）時(shí)菌落生長(zhǎng)無(wú)顯著性差異。
2.3 pH對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響
通過(guò)表2可以看出，隨pH增大，鏈格孢菌菌落直徑呈先增大后減小趨勢(shì)。當(dāng)pH為6時(shí)，菌落生長(zhǎng)速度最快，平均直徑為9.0 cm；pH為7時(shí)，平均直徑7.1 cm；當(dāng)pH大于7時(shí)，菌落生長(zhǎng)受到抑制；當(dāng)pH為9時(shí)，菌落直徑最小，為2.7 cm。對(duì)不同pH下菌落直徑方差分析的結(jié)果表明，不同的pH對(duì)鏈格孢菌菌落的生長(zhǎng)有顯著影響。pH為6時(shí)，與其余各pH下的處理差異達(dá)極顯著水平；pH為5和pH為8的處理之間差異不顯著，均與pH為9的處理差異極顯著。
表2不同pH對(duì)菌落直徑的影響
3小結(jié)
1）通過(guò)對(duì)白三葉草鏈格孢菌進(jìn)行分離，純化培養(yǎng)，觀察其菌落形態(tài)、顏色、大小、生長(zhǎng)速度，并在顯微鏡下觀察其分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)特征，鑒定該病原菌為半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗色孢科、鏈格孢屬真菌。這與李晶等人報(bào)道的結(jié)果相吻合。
2）溫度、pH對(duì)菌落生長(zhǎng)有一定的影響。在PDA培養(yǎng)基上，25℃處理下菌落生長(zhǎng)最快，大于或小于25℃對(duì)菌落生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，故白三葉草鏈格孢菌生長(zhǎng)的適溫為25℃。pH為6時(shí)，菌落生長(zhǎng)速度最快，pH大于7或小于6對(duì)菌落生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，故白三葉草鏈格孢菌在弱酸性的環(huán)境下生長(zhǎng)速度最快。
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