超聲波處理對(duì)谷氨酸棒狀桿菌生長、形態(tài)、通透性的影響
為了提高菌株發(fā)酵的產(chǎn)量、質(zhì)量以及安全性，我們提出了多種工藝強(qiáng)化的方法。在這里報(bào)道其中的一種，在分批補(bǔ)料發(fā)酵的同時(shí)，應(yīng)用超聲波對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行處理從而來提高谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)L-亮氨酸的能力。進(jìn)一步采用響應(yīng)面法對(duì)超聲條件進(jìn)行優(yōu)化。在超聲功率密度為94 W/L、頻率為25kHz、間隔31min、持續(xù)時(shí)間為37s的條件下，谷氨酸棒狀桿菌在44h生產(chǎn)了52.89g/L的L-亮氨酸，較對(duì)照組增加21.6%。超聲波處理提高了L-亮氨酸的生產(chǎn)性能。此外，從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞膜透性和酶活性等方面研究了超聲波處理對(duì)L-亮氨酸發(fā)酵性能的影響。結(jié)果表明，超聲波處理對(duì)于谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)L-亮氨酸是有效的。
研究內(nèi)容
1.不同生長期超聲處理對(duì)谷氨酸棒狀桿菌生物量的影響
谷氨酸棒狀桿菌的生長曲線如圖a所示，作為識(shí)別不同生長期的基線數(shù)據(jù)。培養(yǎng)前4h為延滯期，培養(yǎng)后4h至20h為指數(shù)期，培養(yǎng)20h后進(jìn)入穩(wěn)定期。在進(jìn)行發(fā)酵的同時(shí)應(yīng)用超聲波對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行處理，超聲波處理時(shí)長分別為2、4、8、16、20和24h，超聲波處理對(duì)谷氨酸棒狀桿菌不同生長階段的影響如圖b所示。在滯后期和指數(shù)期開始時(shí)，生物量顯著增加，在8h時(shí)，超聲波處理的谷氨酸棒狀桿菌的生長比對(duì)照增加了15.6%。超聲處理在指數(shù)后期和穩(wěn)定期會(huì)導(dǎo)致生物量顯著下降。超聲波對(duì)微生物有雙重作用：對(duì)細(xì)胞生長的積極影響是可以提高酶的活性和營養(yǎng)物質(zhì)的傳質(zhì)速率，而消極影響是應(yīng)用超聲波所產(chǎn)生的剪切力和自由基。不同生長階段的細(xì)胞對(duì)超聲波的耐受性不同。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇以8h為指標(biāo)進(jìn)行超聲處理。
2.超聲參數(shù)對(duì)谷氨酸棒狀桿菌生長的影響
不同功率和頻率的超聲在液體介質(zhì)中產(chǎn)生穩(wěn)定或瞬態(tài)的液體空化。瞬態(tài)空化發(fā)生在20-100 kHz的低頻處，而超過200kHz的高頻會(huì)導(dǎo)致穩(wěn)定的空化，在高、低聲壓之間產(chǎn)生數(shù)千個(gè)振蕩周期。為提高谷氨酸棒狀桿菌的生物量積累，進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，研究了不同超聲處理參數(shù)對(duì)谷氨酸棒狀桿菌生長的影響。結(jié)果表明，在28kHz、100W/L的脈沖作用0.5h后，開、關(guān)時(shí)間分別為100s和10s時(shí)，肽含量和活細(xì)胞數(shù)量的增幅最大。
3.采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲處理?xiàng)l件
在本研究中，通過回歸分析發(fā)現(xiàn)四個(gè)自變量對(duì)超聲處理下L-亮氨酸產(chǎn)量的影響呈線性關(guān)系。L-亮氨酸受超聲功率密度、頻率、間隔和持續(xù)時(shí)間(所有case的P<0.01)影響。功率密度與頻率、功率密度與間隔、頻率與間隔的交互作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而功率密度與持續(xù)時(shí)間、頻率與持續(xù)時(shí)間、間隔與持續(xù)時(shí)間的交互作用不顯著（P>0.05）。
結(jié)果利用超聲功率密度為94.00W/L、頻率為25.47kHz、間隔時(shí)間為31.13min、持續(xù)時(shí)間為37.04s的預(yù)測(cè)剖面模型得到了L-亮氨酸生產(chǎn)的最佳條件。在最佳超聲處理?xiàng)l件下，L-亮氨酸的最大預(yù)測(cè)效價(jià)為53.36g/L。最終預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間的誤差小于2%。
4.超聲波處理對(duì)谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞形態(tài)的影響
掃描電鏡廣泛用于評(píng)價(jià)微生物的表面特征、形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)。通過掃描電鏡觀察了超聲處理對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響。谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞呈典型的不對(duì)稱桿狀，但超聲培養(yǎng)的谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞較對(duì)照組呈現(xiàn)出不規(guī)則、細(xì)長以及腫脹。
5.超聲波處理對(duì)細(xì)胞通透性的影響
為了確定超聲處理是否影響谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞膜的完整性，我們結(jié)合熒光顯微鏡使用了活性染色來進(jìn)行觀察。應(yīng)用PI和SYTO9雙染時(shí)，細(xì)胞膜完整的細(xì)胞顯示綠色熒光，而受損的細(xì)胞膜允許PI流入，導(dǎo)致呈現(xiàn)紅色熒光。如圖所示，與未處理的對(duì)照組相比，超聲下發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量減少，而發(fā)出紅色熒光的細(xì)胞數(shù)量增加。這說明超聲波處理對(duì)谷氨酸棒狀桿菌的細(xì)胞膜造成了一定程度的損傷。膜通透性的增加也會(huì)導(dǎo)致L-亮氨酸的胞內(nèi)外排，從而減緩L-亮氨酸生物合成途徑中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄衰減和關(guān)鍵酶的反饋抑制。這是超聲提高L-亮氨酸產(chǎn)量的原因之一。此外，穩(wěn)定的微泡振蕩還會(huì)導(dǎo)致H2O2和其其他活性氧的產(chǎn)生，進(jìn)一步使脂質(zhì)和膜蛋白過氧化。脂質(zhì)和膜蛋白過氧化可能是膜通透性增加的原因之一。膜滲透性增強(qiáng)的另一個(gè)可能原因是空化，這直接導(dǎo)致了超聲處理產(chǎn)生的力學(xué)效應(yīng)。超聲在物理和化學(xué)層面上都能增加細(xì)胞膜的通透性。
谷氨酸棒狀桿菌最新研究進(jìn)展
近期，在最近發(fā)表于《先進(jìn)材料》（Advanced Materials）的論文中，研究人員發(fā)現(xiàn)了一種新的方法可以治療因佩戴隱形眼鏡而引起的干眼癥，即在隱形眼鏡中加入能夠分泌潤滑物質(zhì)的細(xì)菌。
市面上有許多隱形眼鏡中都添加了透明質(zhì)酸，相比于眼藥水，它們能更持久地緩解干眼癥。德爾·坎波表示，眼藥水的作用只能保持幾分鐘。
然而，含有透明質(zhì)酸的鏡片仍然不足以徹底解決這個(gè)問題。德爾·坎波指出，為了不影響隱形眼鏡鏡片的光學(xué)性能，廠家只能在其中添加少量的透明質(zhì)酸，因此緩解效果最多只能維持幾個(gè)小時(shí)。之后，使用者可能仍然需要眼藥水。
能夠分泌透明質(zhì)酸的細(xì)菌可以補(bǔ)充透明質(zhì)酸，或能為這個(gè)問題提供了解決方案。“細(xì)菌分泌的潤滑劑會(huì)擴(kuò)散到隱形眼鏡的表面。”德爾·坎波說，“盡管淚液會(huì)不斷清除潤滑劑，但是隱形眼鏡表面具有自我更新功能，可以提供永久的潤滑作用。”這樣使用者就不再需要滴眼藥水，且可以較為舒適地配戴隱形眼鏡更長時(shí)間。
研究中使用的是谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum），這是一種天然存在于土壤的、無害的細(xì)菌，不會(huì)產(chǎn)生毒素。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）也認(rèn)可對(duì)于人體來說，它是一種安全的細(xì)菌。
長期以來，谷氨酸棒狀桿菌因合成氨基酸的能力而受到廣泛關(guān)注。在工業(yè)領(lǐng)域，谷氨酸棒狀桿菌用于合成生產(chǎn)食品調(diào)味料、防曬霜等一系列產(chǎn)品的原料。它也經(jīng)過生物工程改造后，用于生產(chǎn)醫(yī)療和制藥行業(yè)所需的氨基酸。德爾·坎波說："它是生物技術(shù)生產(chǎn)中的主力軍”。
研究人員在這項(xiàng)研究中選擇谷氨酸棒狀桿菌不僅因?yàn)樗梢酝ㄟ^生物工程改造分泌透明質(zhì)酸，還因?yàn)樗土硪环N棒狀桿菌Corynebacterium mastitidis的親緣關(guān)系很近，而后一種棒狀桿菌是一種天然存在于人眼中的益生菌。
目前，市面上的隱形眼鏡只能提供少量的透明質(zhì)酸用來潤滑，而谷氨酸棒狀桿菌只要可以獲得營養(yǎng)物質(zhì)，就能不斷制造透明質(zhì)酸。