重組?口蹄疫病毒鑒定、生長特性測定及滅活疫苗制備（二）
2結(jié)果與分析
2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
凝膠電泳鑒定正確的重組質(zhì)粒pOFS/NXVP1/TURG-H用PstⅠ進(jìn)行酶切鑒定，凝膠電泳結(jié)果表明，產(chǎn)生了約591、3 282、7 200 bp的條帶，與預(yù)期大小相符。測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒含有預(yù)期替換的G-H環(huán)基因。
2.2重組FMDV的拯救
重組質(zhì)粒pOFS/NXVP1/TURG-H經(jīng)NotⅠ酶線性化，轉(zhuǎn)染BSR/T7細(xì)胞2 d后，部分細(xì)胞可見典型的FMDV致細(xì)胞病變效應(yīng)，而未轉(zhuǎn)染線性DNA的細(xì)胞未出現(xiàn)CPE。當(dāng)約80%?90%的轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)CPE時收集細(xì)胞，反復(fù)凍融后繼續(xù)在BHK-21細(xì)胞上連續(xù)傳代。
2.3重組FMDV的鑒定
2.3.1 RT-PCR
收集的轉(zhuǎn)染樣品以VP1-F和VP1-R為引物，RT-PCR擴(kuò)增VP1結(jié)構(gòu)蛋白基因。瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增出符合預(yù)期大小的白亮條帶。對該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明重組病毒rHN/NXVP1/TURG-H含有替換的基因片段，說明成功構(gòu)建了重組FMDV。
2.3.2免疫熒光試驗
免疫熒光試驗如圖2所示，拯救的重組病毒感染的BHK-21細(xì)胞能與FMDV 3A單抗反應(yīng)，可見特異綠色熒光，而對照細(xì)胞與FMDV 3A單抗作用未見熒光，表明拯救的重組病毒為FMDV。
圖2重組FMDV的IFA鑒定
2.4重組FMDV的噬斑表型鑒定和生長曲線
重組FMDV和親本病毒的噬斑表型如圖3所示，rHN/NXVP1[(4.27±1.44)nm]和rHN/NXVP1/TURG-H[(4.11±1.39)nm]均可形成形態(tài)相似、平均直徑相近的噬斑；一步生長曲線表明重組FMDV的復(fù)制動力學(xué)與親本病毒相似，但重組FMDV的病毒滴度略低于(P>0.05)親本病毒，說明FMD疫苗毒株G-H環(huán)基因的替換未明顯影響病毒在BHK-21細(xì)胞上的復(fù)制。
圖3 FMDV的噬斑形態(tài)和一步生長曲線
A：FMDV噬斑表型.B：FMDV一步生長曲線
2.5病毒中和試驗
免疫豬28 d的血清用微量中和試驗檢測針對ME-SA、SEA和Cathay共3個拓?fù)湫偷?個譜系病毒株的中和抗體水平。如圖4所示，該結(jié)果表明親本病毒rHN/NXVP1和重組病毒rHN/NXVP1/TURG-H疫苗均產(chǎn)生了針對ME-SA、SEA拓?fù)湫筒《颈Ｗo(hù)性中和抗體(WOAH規(guī)定中和抗體≥1.65log10為保護(hù))，其中親本病毒rHN/NXVP1疫苗免疫的豬(5/6)產(chǎn)生了針對O/NXYCh/CHA/2018和O/XJ/CHA/2017病毒保護(hù)性中和抗體，3/6免疫豬產(chǎn)生了針對O/HB/HK/99病毒保護(hù)性的中和抗體，但未產(chǎn)生針對O/GXCX/CHA/2018保護(hù)性中和抗體；而重組病毒rHN/NXVP1/TURG-H疫苗免疫豬均產(chǎn)生了針對O/NXYCh/CHA/2018、O/XJ/CHA/2017和O/HB/HK/99病毒保護(hù)性的中和抗體，但只有1/6的豬產(chǎn)生了針對O/GXCX/CHA/2018病毒保護(hù)性的中和抗體。結(jié)果說明，疫苗株G-H環(huán)基因的替換顯著提高了重組病毒對當(dāng)前流行的O型SEA和ME-SA拓?fù)湫虵MDV的交叉反應(yīng)性(P<0.05)。
圖4 FMDV疫苗免疫豬血清中和流行毒株的平均抗體效價
3討論與結(jié)論
近年來，反向遺傳操作技術(shù)的發(fā)展為RNA病毒蛋白功能、致病機(jī)制機(jī)理以及新型疫苗創(chuàng)制等方面的研究提供了便利。通過反向遺傳操作技術(shù)嵌合RNA病毒不同血清型、亞型毒株主要免疫蛋白或者優(yōu)勢抗原表位，能夠提高疫苗株與流行毒株的交叉反應(yīng)性，拓展病毒的抗原譜。如Kim等以禽流感病毒(avian influenza viruses,AIV)Apdm09株(H1N1亞型)為骨架，構(gòu)建了嵌合H9N2亞型AIV的HA1區(qū)域和H5N8亞型AIV的HA2區(qū)域的重組AIV，該病毒制備的滅活疫苗免疫動物能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平抗H9和H5亞型AIV的中和抗體，并能夠保護(hù)小鼠免遭這2個亞型AIV的攻擊。Liao等在豬瘟病毒(classic swine fever virus,CSFV)(C株，基因1型)感染性克隆的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了嵌合CSFV流行毒株(基因型2)E2蛋白N端抗原高變區(qū)1(90 bp)的重組病毒RecC-HAR1，該病毒的抗血清能很好地中和基因1型和2型的CSFV，表明嵌合CSFV高變抗原區(qū)，提高了不同基因型CSFV之間的交叉反應(yīng)性。Rieder等發(fā)現(xiàn)嵌合O型或C型A12 FMDV G-H環(huán)的豚鼠抗血清能同時中和A型和O型或A型和C型FMDV，而嵌合C型G-H環(huán)A12 FMDV疫苗免疫豬也能產(chǎn)生交叉中和抗體，能完全保護(hù)豬免遭A型FMDV的攻擊，部分保護(hù)豬免遭C型FMDV的攻擊。鑒于此，本研究也利用已建立FMDV的感染性克隆，構(gòu)建含3個拓?fù)湫?Cathay+ME-SA+SEA)病毒株結(jié)構(gòu)蛋白，主要免疫基因的嵌合FMDV，以期篩選抗原高效、廣譜拓展的FMD疫苗候選毒株。
FMD疫苗株的篩選方法主要有2種：體內(nèi)試驗和體外試驗。其中體內(nèi)試驗耗時、費(fèi)力，而且需要價格昂貴的靶動物和高級別生物安全實驗室，而體外實驗操作簡單，成本低廉。另外，F(xiàn)MD疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的水平與免疫動物的保護(hù)密切相關(guān)。一般情況下，動物中和抗體水平越高，保護(hù)率越高。因此，本研究首選體外微量病毒中和試驗檢測重組病毒和親本病毒疫苗免疫豬血清對3個拓?fù)銯MDV的交叉中和能力，初步評價其作為豬O型FMD疫苗候選株的潛力。本研究結(jié)果表明，與親本病毒疫苗一樣，重組病毒疫苗免疫豬均能產(chǎn)生抵抗SEA和ME-SA拓?fù)湫筒《颈Ｗo(hù)性平均交叉中和抗體水平(>1.65log10)，不能對Cathay譜系病毒產(chǎn)生保護(hù)性平均交叉中和抗體水平(<1.65log10)，但O/TUR/5/2009疫苗株G-H環(huán)基因的替換顯著提高了重組病毒對當(dāng)前流行的SEA和ME-SA拓?fù)湫虵MDV的交叉反應(yīng)性(P<0.05)，推測這種免疫差異可能與G-H環(huán)上包含的免疫優(yōu)勢的抗原表位有關(guān)，但具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
本研究構(gòu)建的含3個拓?fù)湫虵MDV結(jié)構(gòu)蛋白基因的重組病毒疫苗免疫豬顯著提高了對O型SEA和ME-SA拓?fù)湫虵MDV的交叉反應(yīng)性，對未來FMD疫苗的設(shè)計具有重要的指導(dǎo)意義。
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